LAPORAN TETAPPRAKTIKUM BIOKIMIA

NAMA PERCOBAAN: Kromatografi Lapis Tipis (KLT)HARI/TANGGAL: Jumat / 14 November 2014I. Tujuan Percobaan: 1. Mengetahui cara pemisahan asam amino dengan KLT2. Mengetahui harga Rf asam amino

II. Dasar TeoriKromatografi Lapis Tipis (KLT) merupakan cara pemisahan campuran senyawa menjadi senyawa murninya dan mengetahui kuantitasnya yang menggunakan. Kromatografi juga merupakan analisis cepat yang memerlukan bahan sangat sedikit, baik penyerap maupun cuplikannya.Kromatografi Lapis Tipis (KLT) adakah suatu teknik yang sederhana yang banyak digunakan,metode ini menggunakan lempeng kaca atau lembaran plastik yang ditutupi penyerap atau lapisan tipis dan kering. Untuk menotolkan karutan cuplikan pada kempeng kaca, pada dasarya menggunakan mikro pipet atau pipa kapiler. Setelah itu, bagian bawah dari lempeng dicelup dalam larutan pengulsi di dalam wadah yang tertutup ( Barseoni, 2005). Kromatografi lapis tipis menggunakan plat tipis yang dilapisi dengan adsorben seperti silika gel, aluminium oksida (alumina) maupun selulosa. Adsorben tersebut berperan sebagai fasa diam. Fasa gerak yang digunakan dalam KLT sering disebut dengan eluen. Pemilihan eluen didasarkan pada polaritas senyawa dan biasanya merupakan campuran beberapa cairan yang berbeda polaritas, sehingga didapatkan perbandingan tertentu. Eluen KLT dipilih dengan caratrial and error.Kepolaran eluen sangat berpengaruh terhadap Rf (faktor retensi) yang diperoleh. Faktor retensi (Rf) adalah jarak yang ditempuh oleh komponen dibagi dengan jarak yang ditempuh oleh eluen.

Rumus faktor retensi adalah:

Nilai Rf sangat karakterisitik untuk senyawa tertentu pada eluen tertentu. Hal tersebut dapat digunakan untuk mengidentifikasi adanya perbedaan senyawa dalam sampel. Senyawa yang mempunyai Rf lebih besar berarti mempunyai kepolaran yang rendah, begitu juga sebaliknya. Hal tersebut dikarenakan fasa diam bersifat polar. Senyawa yang lebih polar akan tertahan kuat pada fasa diam, sehingga menghasilkan nilai Rf yang rendah.Rf KLT yang bagus berkisar antara 0,2 - 0,8. Jika Rf terlalu tinggi, yang harus dilakukan adalah mengurangi kepolaran eluen, dan sebaliknya (Ewing Galen Wood, 1985).KLT dapat dipakai dengan dua tujuan. Pertama, dipakai selayaknya sebagai metode untuk mencapai hasil kualitatif, kuantitatifatau preparatif. Kedua, dipakai untuk menjajaki sistem pelarut dan sistem penyangga yang akan dipakai dalam kromatografi kolom atau kromatografi cair kinerja tinggi (Gritteret al,1991).KLT dapat digunakan untuk memisahkan senyawa senyawa yang sifatnya hidrofobik seperti lipida lipida dan hidrokarbon yang sukar dikerjakan dengan kromatografi kertas. KLT juga dapat berguna untuk mencari eluen untuk kromatografi kolom, analisis fraksi yang diperoleh dari kromatografi kolom, identifikasi senyawa secara kromatografidan isolasi senyawa murni skala kecil. Pelarut yang dipilih untuk pengembang disesuaikan dengan sifat kelarutan senyawa yang dianalisis. Bahan lapisan tipis seperti silika gel adalah senyawa yang tidak bereaksi dengan pereaksi pereaksi yang lebih reaktif seperti asam sulfat. Data yang diperoleh dari KLT adalah nilai Rf yang berguna untuk identifikasi senyawa. Nilai Rf untuk senyawa murni dapat dibandingkan dengan nilai Rf dari senyawa standar. Nilai Rf dapat didefinisikan sebagai jarak yang ditempuh oleh senyawa dari titik asal dibagi dengan jarak yang ditempuh oleh pelarut dari titik asal. Oleh karena itu bilangan Rf selalu lebih kecil dari 1,0.

Pelaksanaan KLT1. Fase DiamFase diam yang digunakan dalam KLT merupakan penjerapberukuran kecil dengan diameter partikel antara 10-30 m. Semakin kecil ukuran rata-rata partikel fase diam dan semakin sempit kisaran ukuran fase diam, maka semakin baik kinerja KLT dalam hal efisiensi dan resolusinya.Penjerap yang paling sering digunakan adalah silika dan serbuk selulosa, sementara mekanisme sorpsi yang utama pada KLT adalahadsorpsidanpartisi(Gandjar & Rohman, 2007).2. Fase GerakFase gerak pada KLT dapat dipilih dari pustaka, tetapi lebih sering dengan mencoba-coba karena waktu yang diperlukan hanya sebentar. Sistem yang paling sederhana ialah campuran 2 pelarut organik karena daya elusi campuran kedua pelarut ini dapat mudah diatur sedemikian rupa sehingga pemisahan dapat terjadi secara optimal. Berikut adalah beberapa petunjuk dalam memilih dan mengoptimasi fase gerak: Fase gerak harus mempunyai kemurnian yang sangat tinggi karena KLT merupakan teknik yang sensitif. Daya elusi fase gerak harus diatur sedemikian rupa sehingga harga Rf terletak antara 0,2-0,8 untuk memaksimalkan pemisahan. Untuk pemisahan dengan menggunakan fase diam polar seperti silika gel, polaritas fase gerak akan menentukan kecepatan migrasi solut yang berarti juga menentukan nilai Rf. Penambahan pelarut yang bersifat sedikit polar seperti dietil eter ke dalam pelarut non polar seperti metil benzene akan meningkatkan harga Rf secara signifikan (Gandjar & Rohman, 2007).Tabel. Beberapa Sistem Pemisahan dengan KLT dari Bahan Alam (Gibbons, 2006)EluenFase DiamKeterangan

Heksan : Etil asetatSilika GelSistem umum yang digunakan

Petrol : DietileterSilika GelSistem umum yang digunakan untuk senyawa nonpolar seperti terpen dan asam lemak

Petrol : KloroformSilika GelBerguna untuk pemisahan derivat asam sinamat dan kumarin

Toluen : Etil asetat : Asam asetat (TEA)Silika GelKomposisi 80:18:2 v/v atau 60:38:2 v/v baik untuk pemisahan metabolit asam

Kloroform : AsetonSilika GelSistem umum untuk produk dengan polaritas sedang

n-Butanol : Asam Asetat : AirSilika GelSistem polar untuk flavonoid dan glikosida

Metanol : AirC18Dimulai dengan metanol 100% dilanjutkan dengan penambahan konsentrasi air

Asetonitril : AirC18Sistem umumReverse phase

Metanol : AirSelulosaMemisahkan senyawa dengan kepolaran tinggi seperti gula dan glikosida

3. Penotolan SampelUntuk memperoleh roprodusibilitas, volume sampel yang ditotolkan paling sedikit 0,5 l. Jika volume sampel yang ditotolkan lebih besar dari 2-10 l, maka penotolan harus dilakukan secara bertahap dengan dilakukan pengeringan antar totolan (Gandjar & Rohman, 2007).4. PengembanganBila sampel telah ditotolkan maka tahap selanjutnya adalah mengembangkan sampel dalam bejana kromatografi yang sebelumnya telah dijenuhi dengan uap fase gerak. Tepi bagian bawah lempeng tipis yang telah ditotoli sampel dicelupkan kedalam fase gerak kurang lebih 0,5-1 cm. Tinggi fase gerak dalam bejana harus dibawah lempeng yang telah berisi totolan sampel.Bejana kromatografi harus tertutup rapat dan sedapat mungkin volume fase gerak sedikit mungkin,akan tetapi harus mampu mengelusi lempeng sampai ketinggian lempeng yang telah ditentukan. Untuk melakukan penjenuhan fase gerak, biasanya bejana dilapisi dengan kertas saring. Jika fase gerak telah mencapai ujung dari kertas saring, maka dapat dikatakan bahwa fase gerak telah jenuh (Gandjar & Rohman, 2007).5. Deteksi BercakDeteksi bercak pada KLT dapat dilakukan secara kimia dan fisika. Cara kimia yang biasa digunakan adalah dengan mereaksikan bercak dengan suatu pereaksi melalui cara penyemprotan sehingga bercak menjadi jelas. Cara fisika yang dapat digunakan untuk menampakkan bercak adalah dengan cara pencacahan radioaktif dan fluorosensi sinar ultraviolet. Fluorosensi sinar ultraviolet terutama untuk senyawa yang dapat berfluorosensi, membuat bercak akan terlihat jelas (Gandjar & Rohman, 2007).Deteksi senyawa dilakukan dengan menggunakan detektor UV di bawah sinar UV 254 nm, indikator pada plat KLT akan memancarkan warna hijau dan pada UV 366 nm akan memancarkan warna ungu. Komponen yang menyerap cahaya pada 254 atau 366 nm akan tampak sebagai bercak gelap pada plat yang bercahaya (Gibbons, 2006). Metode deteksi lain adalah dengan menggunakan pereaksi semprot. Pereaksi semprot yang umum digunakan dapat dilihat pada tabel di bawah ini.Tabel. Beberapa Jenis Pereaksi Semprot untuk KLT (Gibbons, 2006)Pereaksi semprotKomposisiPerlakuanKeterangan

Vanilin asam sulfat1 gram vanilin dalam asam sulfat pekatDisemprot dan dipanaskan hingga muncul warnaPereaksi umum yang digunakan. Terpen akan menghasilkan warna merah atau biru

Asam fosfomolibdatAsam fosfomolibdat 5% b/v dalam etanolDisemprot dan dipanaskan hingga muncul warnaUntuk mendeteksi terpen dengan bercak biru berlatar kuning

Reagen Dragendorff10 mL larutan KI 40% ditambahkan dengan 10 mL larutan 0,85 gram bismuth subnitrat dalam 10 mL asam asetat dan 50 mL air. Larutan tersebut diencerkan dalam 10 mL asam asetat dan 50 mL airJika reaksi tidak spontan maka diperlukan pemanasanDeteksi alkaloid menghasilkan warna oranye pekat hingga merah

III. Alat dan Bahan1. alat :2.Bahan :a. pelat kromatografia. silika gelb. selembar kacab. pelarut etanolc. penggiling c. larutan ninhidrind. beker gelasd. larutan Kuprinitrate. pengaduk magnetike. lart. Asam aminof. gelas ukurf. aquadesg. pipet tetesh. penyemproti. penggarisj. pensil

IV. PROSEDUR PERCOBAAN Pembuatan lapis tipis: Plat gelas yang dipakai harus bersih, terutama bebas dari lemak. Timbag 25 gram Silica gel G dan aduk ini dengan 50 ml air dengan pengaduk magnetik sampai homogen. Suspensi ini dimasukkan ke alat pembuatan lapis tipis (alat Stahl atau alat buatan dalam negeri). Tebal lapis tipis adalah sekitar 250 mu. Biarkan lapis tipis ini ditempatnya kira-kira 10 menit. Sesudah ini boleh dipindah tempatnya dan dibiarkan kering diudara selama semalam.Meneteskan larutan zat yang akan diperiksa: Zat asam amino yang diperiksa, paling banyak 0,5 2,0 ug dalam 0,5 ul, diteteskan pada plat silica gel kira-kira 1 cm dari tepi bawah. Jika banyak macam zat yang akan diselidiki maka ini dapat diteteskan sejajar dengan jarak kira-kira 1 cm antara dua zat dan kira-kira 1,5 cm dari tepi sisi. Penetesan harus dilakukan dengan hati-hati seklai supaya permukaan lapis tidak rusak. Tempat-tempat pada plat yang akan ditaruh (ditetesi) dengan alrutan-larutan zat tersebut, sebelum diberi titik dengan ujung pensil yang runcing, guna mengetahui kelak titik-titik permulaan. Lubang-lubang yang kecil ini tidak akan banyak mempengaruhi bentuk noda.Sebelum eluaen dijalankan maka tetesan-tetesan tersebut harus dibiarkan dulu sampai kering.Ruang Kromatografi: Ruang kromatografi harus dapat ditutup dengan rapat. Ruang ini diisi dengan eluaen sedemikian sehingga apabila plat dimasukkan bagian bawahnya terendam sampai bawah tempat tetesan zat-zat yang diselidiki. Dinding ruang harus dilapisi dengan kertas saring yang dibasahi dengan eluen. Ini supaya ruang kromatografi mudah dan cepat dijenuhi dengan uap eluen.Cara melakukan elusi: Plat-plat yang telah ditetesi asam amino dan yang telah kering, dimasukkan ke dalam ruang kromatografi. Disini yang dipakai adalah kromatografi mendaki. Hendaknya suhu dibuat tetap. Kromatografi diberhentikan setelah berjalan sekitar 10 cm. Pada batas ini semulad diberi tanda garis dengan ujung pensil yag runcing. Plat diambil dan dikeringkan pada suhu kamar.Cara perwarnaan:(a) dengan hati-hati disemprot dengan larutan ninhidrin. Asam asetat yang ditambahkan dimasukkan untuk menjaga pH sekitar 5, juga apababila fase gerakj yang dipakai bersifat alkali.Kemudian plat dikeringkan pada 60oC selama 30 menit atau 110oC selama 1`0 menit. Kalau dipanasi lebih lama, maka nantinya plat akan berwarna sedikit rose.(b) untuk menstabilkan noda-noda setelah diwarnakan dengan ninhidrin, maka plat kemudian disemprotkan dengan larutan penyemprot kuprinitrat (lihat bab metrial). Maka akan terjadi ikatan komplek Cu-ninhidrin yang berwarna. Warna ini hanya stabil apabila tidak ada asam bebas. Maka sesudah disemprot, plat harus dikenakan uap amonia. Juga plat tidak boleh terdisoasiasi dalam suasana basa antara pH 7-9. walau disosiasi ini reversibel. Di atas pH 9 disosiasi tersebut bersifta irreversibel.

V. Hasil PengamatanAsam aminoPanjang bercak warna yg dihasilkan (cm)warna

ArgininGlysinAs. GlutamatAlanin8,79,510,59,5BiruOrange kekuninganMerah kekuninganBiru keunguan

VI. Reaksi Kimia

VII. Analisa DataMenghitung Harga RfYaitu perbandingan antara jarak yang ditempuh asam amino dengan jarak yang ditempauh pelarut dari awal hingga garis akhir.Asam aminoPanjang bercak warna yang dihasilkan (cm)Warna

ArgininGlysinAsam GlutamatAlanin8,79,510,59,5Biru Orange kekuninganMerah kekuninganBiru keunguan

Rf = jarak yang ditempuh oleh komponen jarak yang ditempuh oleh pelarut

1. Pada Arginin, Rf = jarak yang ditempuh oleh komponen jarak yang ditempuh oleh pelarut

Rf = 2. Pada GlysinRf = jarak yang ditempuh oleh komponen jarak yang ditempuh oleh pelarut

Rf =

3. Pada Asam GlutamatRf = jarak yang ditempuh oleh komponen jarak yang ditempuh oleh pelarut

Rf = 4. Pada AlaninRf = jarak yang ditempuh oleh komponen jarak yang ditempuh oleh pelarut

Rf =

VIII. Pembahasan Pada percobaan kali ini yaitu kromatografi lapis tipis dan lebih dikenal dengan singkatan KLT. Sesuai dengan tujuan percobaan yakni untuk mengetahui bagaimana cara pemisahan asam amino dengan kromatografi lapis tipis serta mengetahui harga Rf asam amino yang digunakan. Adapun dalam hal ini, asam amino yang diuji untuk membuktikan dan membandingkan harga Rf satu sama lain ialah arginin, glysin, asam glutamat dan alanin. Pada percobaan ini, teknik kromatografi lapis tipis yang digunakan adalah suatu plat tipis yang fungsinya untuk tempat berjalannya adsorben sehingga proses migrasi analit oleh solventnya bisa berjalan. Hal inilah yang membedakan antara kromatografi kertas dengan kromatografi lapis tipis. Dimana Kromatografi Lapis Tipis menggunakan plat tipis sedangkan pada Kromatografi Kertas menggunakan kertas (lapisan selulosa) menyebabkan proses elusinya lebih lama. Dalam Kromatografi Lapis Tipis adsorben yang digunakan berupa silika gel (SiO2) yang tidak mengikat molekul air, sehingga noda yang tercipta lebih terfokus dan tajam. Pembuatan lapisan silika gel pada plat kaca, harus secara hati-hati dan juga harus menggunakan plat kaca yang benar-benar bersih dan terbebas dari lemak. Kemudian, siilika gel yang telah dibuat pada plat kaca terlebih dahulu dikeringkan baru bisa digunakan.Hal yang pertama sekali dilakukan ialah menyiapkan jarak titik cotolan masing-masing komponen (asam amino) pada silica gel. Lalu mengukur jarak tempuh eluen yang digunakan sebagai pembanding dalam menghitung/menentukan harga Rf masing-masing komponen. Dalam percobaan, kami menggunakan jarak tempuh eluennya 10 cm. Perlu diketahui bahwa pada pencotolan/penetesan asam amino perlu dilakukan secara hati-hati agar lapis tipis silika gelnya tidak rusak. Setelah dilakukan penetesan asam amino maka eluen siap dijalankan. Eluen pun berjalan tergantung dengan lapis silikan gel yang dibuat. Bila lapisan silika gel yang kita buat terlalu tebal maka eluen pun akan berjalan lambat, dan juga sebaliknya. Oleh karena itu, pembuatan lapisan silikanya diusahakan setipis mungkin dan merata. Dan bila sudah sampai 10 cm, maka eluen yang berjalan dihentikan. Kemudian dikeringkan.Langkah selanjutnya, melihat jarak bercak noda asam amino dapat disemprotkan dengan larutan ninhidrin agar terbentuk warna. Di sini, ninhidrin berfungsi untuk melacak jalannya asam amino dengan menimbulkan warna ungu pada asam amino. Ninhidrin (2,2-Dihydroxyindane-1,3-dione) adalah suatu larutan yang akan digunakan untuk mendeteksi adanyagugusamina.Apabila pada sampel terdapat gugus amina maka ninhidrin akan bereaksi menjadi berwarna ungu.Biasanya padatan ninhidirn ini dilarutkan dalam larutan butanol. Selain itu, warna yang terbentuk tidaklah stabil. Maka perlu adanya penyemprotan larutan lagi dengan larutan Kuprinitrat. Sehingga terbentuklah noda yang berwarna ungu. Hal ini terjadi karena terbentuknya Cu-ninhidrin. Bagus tidak hasilnya sangat dipengaruhi oleh tebal atau tipisnya silika gel yang dibuat. Dari data hasil percobaan didapatlah jarak noda oleh masing-masing komponen, yaitu arginin = 8,7 cm; glysin = 9,5 cm; asam glutamat = 10,5 cm; dan alanin = 9,5 cm. Selanjutnya, dilakukan perhitungan untuk mendapatkan nilai Rf masing-masing komponen memalui rumus menentukan nilai Rf. Setelah dilakukan perhitungan didapatlah nilai Rf masing-masing komponen, yaitu arginin = 0,87; glysin = 0,95; asam glutamat = 1,05; dan alanin = 0,95. Dari hasil yang didapat bila dibandingkan dengan nilai Rf komponen yang sebenarnya sangat jauh bebeda, yang mana nilai Rf sebenarnya masing-masing komponen ialah arginin = 0,20; glysin = 0,26; asam glutamat = 0,36; dan alanin = 0,38. Perbandingan yang sangat signifikan bila kita perhatikan. Apa yang menyebabkan hal tersebut bisa terjadi?. Hal ini disebabkan oleh pada saat penyemprotan permukaan silica oleh ninhidrin dan cuprinitrat dilakukan dari depan atau searah jalannya noda komponen yang dihasilkan, sehingga ada kemungkinan noda masing-masing komponen bergeser lebih jauh akibat penyemprotan yang searah tadi. Oleh sebab itu, harus kita perhatikan bahwa pada saat penyemprotan dilakukan dengan posisi penyemprotan tegak lurus terhadap permukaan silica gel sehingga noda tidak bergeser.IX. Kesimpulan1. Nilai Rf masing-masing komponen, yaitu arginin = 0,87; glysin = 0,95; asam glutamat = 1,05; dan alanin = 0,95.2. Dari data hasil percobaan didapatlah jarak noda oleh masing-masing komponen, yaitu arginin = 8,7 cm; glysin = 9,5 cm; asam glutamat = 10,5 cm; dan alanin = 9,5 cm. Setelah dilakukan perhitungan didapatlah nilai Rf masing-masing komponen, yaitu arginin = 0,87; glysin = 0,95; asam glutamat = 1,05; dan alanin = 0,95. Dari hasil yang didapat bila dibandingkan dengan nilai Rf komponen yang sebenarnya sangat jauh bebeda, yang mana nilai Rf sebenarnya masing-masing komponen ialah arginin = 0,20; glysin = 0,26; asam glutamat = 0,36; dan alanin = 0,38.3. Untuk memberikan warna pada noda atau bintik yang dihasilkan kita dapat menggunakan larutan ninhidrin dan larutan kuprinitrat sebagai penstabil warnanya.4. Salah satu faktor penyebab data Rf (percobaan) tidak sesuai dengan nilai Rf sebenarnya ialah posisi pada saat penyemprotan komponen di silica gel.5. Posisi penyemprotan harus tegak lurus terhadap permukaan silica gel sehingga noda tidak bergeser.

X. Daftar PustakaAdonara, Erlinda. 2013. Kromatografi Lapis Tipis. (online) http://erlindaadonara.blogspot.com/2013/09/kromatografi-lapis-tipis.htmlDiakses pada tanggal 20 November 2014-11-20Anonim. 2013. Kromatografi Lapis Tipis. (online) http://www.ilmukimia.org/2013/05/kromatografi-lapis-tipis-klt.htmlDiakses pada tanggal 20 November 2014Lehninger.1982. Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta: Erlangga.