Odgovori na pitanja• 1. Koja suvremenija metoda može zamijeniti Northern blot da bi

analizirali ekspresiju gena? RT-PCR za pojedinačne gene, mikročipovi za više gena istovremeno

• 2. Koja suvremenija metoda od RFLP može otkriti polimorfizme? HRM (high resolution melt) i odrđene modifikacije PCR-a, a da se ne sekvencira...

• 3. Koji korak nije potreban u Northern blottingu u odnosu na Southern? Ne treba porezati restrikcijskim enzimima

• 4. Navedite bar dvije mane sustava CRISPR-Cas – mogućnost vezanja gRNA na više mjesta (nespecifičnost), niska efikasnost, teško se ubacuje u stanice...

• 5. Što je dCas9 i navedite bar dvije primjene – to je enzim koji nije nukleza (katalitički mrtav „dead”) i samo se veže na DNA. Može biti represor, ako mu se doda transkripcijski aktivator može aktivirati transkripciju, ako mu se doda GFP može označiti neko mjesto u genomu, ako se doda metilaza može metilirati DNA...

Osnovne metode molekularne biologije

-SEKVENCIRANJE-MIKROČIPOVI

SEKVENCIRANJE

Tehnika kojom se određuje redoslijed nukleotida molekule DNA.

SANGEROVA ili DIDEOKSI METODA

Upotreba u:GeneticiMediciniForenziciEkologijiMolekularnoj biologijiTaksonomijiKrižanju

kalup

obilježena POČETNICA

Smjer elektroforeze

5’

3’

Sekvenca komplementarna kalupu

Svodi se na PCR s dideoksinukleotidima

Što je sekvenca kalupa?

Poliakrilamidna gel elektroforeza

ddATP

ddCTP ddGTP

ddTTP

A C G T

Sve molekule DNAimaju ISTI 5’ kraj i različiti 3’ kraj (različite dužine)

A C G T A C G T

http://www.youtube.com/watch?v=vK-HlMaitnE

http://www.youtube.com/watch?v=vK-HlMaitnE

početnica

Upotreba fluorescentno obilježenih ddNTP-a!!!Kako se terminirajući nukleotidi mogu razlikovati po boji, onda se sve četiri reakcije se mogu napraviti u jednoj epruveti. Dakle, fragmenti se mogu razlučiti i po veličini i po boji!

Sangerova metoda danas

kapilara

GTCTGA

gel

GA

TCG A T C

Sangerova metoda danas

Ljestvica DNA se razdvoji u jednoj stazi u gelu ili na kapilari

• Ljestvica DNA se čita na elektroferogramu.Softverom se sekvenca prezentira kao tekst ili elektroferogram.

kapilaragel

5′ AGTCTG

Elektroferogram

Sangerova metoda danas

https://www.youtube.com/watch?v=wdS3j0TgbjM

https://www.youtube.com/watch?v=wdS3j0TgbjM

SEKVENCIRANJE

• Prvi sekvencirani genom DNA bio je bakteriofag X174, 1977

• Prva poluautomatizirana mašina za sekvenciranje napravljena je 1986, a prva automatizirana napravljena je već 1987.

• U početku je cijena sekvenciranja iznosila oko US $0.75 po bazi, a danas je cijena već oko 6 puta manja

• U međuvremenu su razvijane nove metode sekvenciranja, a Sangerova metoda se još zove tehnologija “prve generacije”, a nove metode se zovu tehnologije slijedeće generacije (“next-generation sequencing” ili NGS)

Sekvenciranje

pitanja

• 1. Koje su dvije osnovne razlike između „običnog” PCR i Sangerovog sekvenciranja?

• 2. Koje su sličnosti između „običnog” PCR i Sangerovog sekvenciranja?

• 3. Ako je gen duži od 3000 pb je li ga moguće sekvencirati Sangerovom metodom i kako?

Sekvenciranje čitavih genomaviših organizama

• Prije par desetljeća nemoguć i skup projekt

• U projektu ljudskog genoma (human genome project) započeo je 1990. sudjelovale su dvije skupine znanstvenika:

– Eric Lander (International human genome sequencing consortium)

– Craig Venter (Celera Genomics) – priključio se kasnije

• Rezultati sekvenciranja su objavljeni u časopisima Nature i Science 2001., a konačana verzija 2003.

Dva pristupa sekvenciranju

• Shotgun sequencing (sekvenciranje metodom sačmarice) – koristili Celera– Nasumično kidanje genoma u manje fragmente

– Njihovo višestruko sekvenciranje da se pokrije cijeli genom

– Povezivanje preklapajućih fragmenata u jedinstvenu sekvencu

http://www.youtube.com/watch?v=vg7Y5EeZsjk

http://www.youtube.com/watch?v=vg7Y5EeZsjkhttp://www.youtube.com/watch?v=vg7Y5EeZsjk

• Ordered clone sequencing (sekvenciranje uređenih klonova) –Human genome project– Podjela kromosoma u manje dijelove (eng. contigs)

– Sekvenciranje svakog dijela (nije potrebno višestruko, jer su poznata mjesta preklapanja)

– Sklapanje dijelova u jedinstvenu sekvencu

Dva pristupa sekvenciranju

Sekvenciranje ljudskog genoma

• Razlozi sekvenciranja ljudskog genoma:

– Proučavanje populacija

– Razumijevanje bolesti – naći mutacije u genima povezane s određenim bolestima

– Analiza razlika među pojedincima (MANJE od 0.1% !)

https://www.youtube.com/watch?v=MvuYA

Th7Y74

https://www.youtube.com/watch?v=MvuYATh7Y74

Next generation sequencing

• Različiti proizvođači (platforme) i metode sekvenciranja

• Najpoznatiji proizvođači i platforme:– Roche/454 (pirosekvenciranje)

– Illumina/Solexa

– Life/APG

– Nanopore

– Ion Torrent

• Istodobno se vrši paralelno sekvenciranje velikog broja sekvenci: kalup (genomska DNA se pocijepa nasumično na puno fragmenata koji se imobiliziraju na krutu površinu)

• Obavezno je pripremiti „biblioteku” fragmenata DNA

• Osnovne metode sekvenciranja su: 1. piroskevenciranje

2. Sekvenciranje sintezom 3. Sekvenciranje ligacijom 4.ionsko poluvodičko sekvenciranje 5. nanopore sekvenciranje

Next generation sequencing

Usporedba različitih tehnologija

http://www.youtube.com/watch?v=HMyCqWhwB8E

https://www.youtube.com/watch?v=jFCD8

Q6qSTM

Cijena sekvenciranja se sve jeftinija!

http://www.youtube.com/watch?v=HMyCqWhwB8Ehttps://www.youtube.com/watch?v=jFCD8Q6qSTM

• Funkcionalna genomika

❑ Istraživanje ekspresije velikog broja gena

• Transkriptomika

❑ Istraživanje transkriptoma (svi transksripti određenog organizma u bilo kojem vremenu)

• Proteomika

❑ Istraživanje proteoma (set eksprimiranih proteina u određenom tipu stanica ili organizma u određenom vremenu i definiranim uvjetima)

Sekvenciranje je omogućilo razvijanje novih grana biologije: funkcionalna genomika,

transkriptomika/proteomika

Metagenomika

• Općenito pojam označava sumu svih genomskih informacija sadržanu u biotipu ili simbiotskoj zajednici

• Primjerice, mogu se istraživati mikrobiološke zajednice u kanalizaciji, crijevima ljudi ili životinja, u tlu, vodi...

• DNA se izolira iz tla i pocijepa na fragmente koji se zatim sekvenciraju

• Puno se može doznati o organizmima koje ne možemo kultivirati i simbiotskim zajednicama

Projekt 1000 genoma

• Od 2008.-2015., uključeno 75 sveučilišta i kompanija u cijelom svijetu

• Cilj projekta: pronaći sve genetičke varijante – male individualne razlike u specifičnim dijelovima ljudskog genoma, razumjeti utjecaj miješanja genoma u predaka na današnji genom

Projekt 1000 genoma

• Plan rada

• Pilot faza (2010/11) ugrubo sekvencirati 179 genoma

• Prva faza - ugrubo sekvenciranje 1092 genoma iz 14 različitih populacija je završena - objavljen je članak u časopisu Nature 2012

• Druga i treća faza (2012/13) ugrubo sekvencirati 2500 genoma i potpunih 500 genoma iz dodatnih 12 novih populacija

• Pronađeno je da svaka osoba ima oko 250-300 inaktiviranih gena i 50-100 varijanti koje su povezane s nasljednim bolestima. Iz nasljeđivanja između oca, majke i djece procjenjeno je stopa de novo mutacije u solnim stanicam oko 10−8 po pb po generaciji

Projekt ENCODE

• Encode = Encyclopedia of DNA Elements

• Projekt financira National Human Genome Research Institute

• Ciljevi: pronaći sve regije koje se aktivno prepisuju, pridružene transkripcijske čimbenike, strukturu kromatina i histonske modifikacije u ljudskom genomu

• Najvažnije otkriće ovog istraživanja: više od 80% ljudskog genoma ima bar jednu biokemijsku ulogu

• Ovo otkriće je naišlo na veliku kritiku jer se pod pojmom “uloga” smatralo sve što se prepisuje

Projekt 1000 biljnih genoma• Sličan projekt na biljkama koji je započeo ubrzo nakon projekta

1000 genoma 2008. Trajao do 2014.

• Cilj: dobiti transkriptom (eksprimirani geni) 1000 različitih biljnih vrsta i odrediti njihove evolucijske odnose

• Upotreba: u biotehnologiji i evoluciji

Projekt Human Longevity(ljudska dugovječnst)

• Ideja: Craig Venter želi do 2020. skupiti podatke o milijun osoba kako bi razumio odnos između gena i biologije. Želi razumjeti na koji način geni i okoliš utječu na ljudsku biologiju.

• Smatra se da 40-50% zdravih ljudi ima ozbiljne, u nekim slučajevima, životno opasne poremećaje kojih nisu svjesni jer nemaju simptome. Smatra se da će se redefinirati pojam zdravlja koje potječe od 14 i 15 stoljeća: Ako nemaš očiglednu bolest, izgledaš i osjećaš se dobro, onda si zdrav.

DNA mikročipovi (microarray)

• Koristi se za proučavanje ekspresije gena u stanici

• Stanice se međusobno mogu jako razlikovati ovisno o količini proteina koji sintetiziraju – zbog različite vrste stanica ili zbog različitih okolišnih čimbenika

• Samo se dio gena eksprimira

• Ovom metodom moguće je istovremeno pratiti ekspresiju i do deset tisuća gena

Tehnologija mikročipova

• Mikročip je veličine pokrovnog stakalca sa točkicama DNA; svaka točkica je sonda ili ciljna DNA

• DNA je jednolančana cDNA, dužine oko 20 nt i predstavlja jedinstvene dijelove nekog gena

• Kad se mikročip pomiješa sa ukupnom mRNA tada će se neke mRNA povezati sa svojim komplementarnim sondama

• Danas se sve više koriste metode bazirane na određivanju sekvence i količine RNA (RNA-seq) čak i rijetkih transkripata bez prethodnog poznavanja određenog gena

Sonde DNA mikročipova

ssDNA oligonukleotidi

Tehnologija mikročipova

• Točkice sondi DNA nanose roboti

• Koje gene možete proučavati ovisi o sondama koje imate

• Proizvođači mikročipova: Affymetrix, Agilent, Amersham

• Jako skupa metoda!

Postupak:1. Izolacija svih mRNA iz stanica (tkiva), bolesno i

zdravo

2. Sinteza cDNA (reverznom transkripcijom) pomoću nukleotida obilježenih fluorescentnom bojom

3. Hibridizacija na mikropločicama

4. Analiza signala

5’ AAAAAAA 3’TTTTTTTT 5’3’

denaturacija

TTTTTTTT 5’3’

Strukture spojeva koji se koriste za fluorescentno obilježavanje nukleotida spojnica

Svojstva nekih fluorokroma…

Interpretacija microarraypodataka

• Postoje “standardni” intenziteti boja

• Crveno znači da je eksperimentalnim uvjetima nastalo više mRNA; Zeleno je u kontrolnim uvjetima nastalo više mRNA.

• Žuto znači podjednaka količina mRNA u eksperimentu i kontroli.

• Crno znači da se ni kontrolna ni eksperimentalna mRNA nije hibridizirala

• Npr. Ako je bilo 5 puta više mRNA u eksperimentalnim uvjetima u odnosu na kontrolu, zaključili bi da je došlo do indukcijeekspresije 5 puta; za 1/5 signala bi rekli da je došlo do 5-putasmanjene ekspresije.

Podaci microarray

https://www.youtube.com/watch?v=6ZzFihESjp0

https://www.youtube.com/watch?v=0ATUjAxNf6U

https://www.youtube.com/watch?v=6ZzFihESjp0https://www.youtube.com/watch?v=0ATUjAxNf6U

Analiza microarray podataka

• Kako ima puno gena, zgodno je grupirati gene na temelju sličnosti u ekspresiji

• U tu svrhu se koriste različiti algoritmi i statistički programi

• Fluorescentna in situ hibridizacija:

• Fluorescentno obilježene sondehibridizirane na kromosome čovjeka:

Za svaki kromosom postoji različitasonda

Pitanja

• 1. Na kojem principu radi metoda nanopore?

• 2. Po čemu je mikročip drugačiji od metode Northen blot? Koje novo pitanje sad možemo postaviti (i dobiti odgovor)?

Seminari• Do sad su se javile 3 kolegice za seminare:

• 1. Helena Turk - rak – što je karcinom, kakve su to tumorske stanice, kako se rakotkriva, metode liječenja i slično ) za 06. 05.

• 2. Patricija Knechtl - usporedba španjolske gripe i covid-19, nismo precizirali datum

• 3. Ana Grizelj – antibiotici - povijest, podjela, način djelovanja, rezistenciji bakterija na antibiotike, alternativni pristupi u liječenju bakterijskih infekcija 13.05.

• Moji prijedlozi:

• 1. metoda detekcije covid-19 (koja se metoda koristi, koliko je pouzdana, ideje za razvoj brze metode trakicama (koliko je to moguće)

• 2. razvoj cjepiva - kakvi tipovi cjepiva postoje i koje su ideje za

• cjepivo provit covid-19, kad se najranije može očekivati

• 3. epidemiološka situacija ove zaraze - kako se širi, mjere zaštite, koliko sojeva virusa cirkulira, ugrožene osobe, smrtnost, predviđanja broja zaraženih,modeliranje

• Teorije zavjere – dokazi protiv da su ljudi pustili virus...