PHÂN IIIMÔT SÔ ƯNG DUNG CHU YÊU

CUA CÔNG NGHỆ GEN

CHƯƠNG VIII

ƯNG DUNG KY CÔNG NGHỆ GEN TRONG Y HOC VA CHÂN

ĐOAN

I. Ky thuât gen trong san xuât chê phâm sinh hoc

1. San xuât insulin tai tô hơp

1.1 Lươc sư nghiên cưu insulin

- Do cac tê bao beta cua tuyên tuy san xuât, đong vai tro chuyên hoa đương

- Bênh tiêu đương (Diabetes) do thiêu hut insulin.

- Tư năm 1922 đa tach chiêt insulin tư tuy bo va lơn đê điêu tri tiêu đương

- Câu truc phân tư insulin ngươi đươc phat hiên vao năm 1926. Năm 1955 Sanger va công sư đa giai trinh tư va săp xêp acid amin

- 1963-1965 đa tông hơp nhân tao băng con đương hoa hoc đăt, không phu hơp

- 1967, phat hiên câu truc proinsulin- 1969, phat hiên 3 dang câu truc- 1978, san xuât insulin tai tô hơp trong

E.coli- 1982, insulin đươc phep lưu hanh ơ châu

Âu. Ban ơ My năm 1983

1.2 Câu truc gen ma hoa insulin ơ ngươi

• Gen ma hoa insulin (IND) năm trên NST số 11, trên canh ngăn (11p)

• Vung không ma hoa chia lam 3 cum gen ký hiêu I, II va III

• Vung ma hoa co kích thước 1430 bp. Trong vung ma co 2 intron.

• Đoan gen ma hoa cho 4 peptid cua phân tư insulin: Chuỗi peptid tín hiêu (leader), chuỗi B, chuỗi C va chuỗi A

Preproinsulin is difficult for E.coli

to produce

Contains a signal sequence

+ A,B, C sections of protein

Signal sequence is removed after targeting

to RER

Translation continues on RER (forming

proinsulin)

Removal of 33 amino acids at Golgi

and S-S joining of A and B chains to form

insulin

Insulin

Insulin is made up of 2 chains = 51 amino acids totalA chain = 21 amino acidsB chain = 30 amino acids

In reality both chains are present in the same protein

1.3 Công nghê san xuât insulin tai tô hơp

Nguyên lý chung bao gồm:

- Tach chiêt va tính sach RNA thông tin ma hoa preproinsulin

- Thưc hiên ky thuât phiên ma ngươc

- Sư dung enzym giới han loai bỏ gen ma hoa chuỗi C, tach dong riêng tưng đoan gen ma hoa chuỗi A va B

- Tao vector biêu hiên gen đoan A va B

- Biên nap riêng mỗi loai vector trong E.coli- Thưc hiên qua trinh lên men thu protein chuỗi A-

lacZ va B-lacZ- Thu riêng tưng loai protein lai va thưc hiên phan

ưng căt với cyanur bromid giữa a.a cuối cung cua insulin va a.a cua -galactosidase

- Tach va tinh sach chuỗi A va B, sau đo tao hỗn hơp chuỗi A va B, hinh thanh cầu nối disulfit va thu insulin thanh phâm

San xuât insulin tai tô hơp

Human Insulin Production by Bacteria

6) join the plasmid and human fragment

and cut with a restriction enzyme

Human Insulin Production by Bacteria

Mix the recombinant plasmid with bacteria.

Screening bacterial cells to learn which contain the human insulin gene is the hard part.

Route to the Production by Bacteria of Human Insulin

A fermentor used to grow recombinant bacteria.

This is the step when gene cloning takes place.

The single recombinant plasmid replicates within a cell.

Then the single cell with many recombinant plasmids produces trillions of like cells with recombinant plasmid – and the human insulin gene.

One cell with the recombinant plasmid

Route to the Production by Bacteria of Human Insulin

The final steps are to collect the bacteria, break open the cells, and purify the insulin protein expressed from the recombinant human insulin gene.

Route to the Production by Bacteria of Human Insulin

Overview of gene cloning.

Cloning animation

2. San xuât hormon sinh trương tai tô hơp

2.1 Lich sư nghiên cưu hormon sinh trương- Hormon sinh trương ngươi (hGH – Human

Growth Hormone) phat hiên năm 1920. Năm 1950 đa tach chiêt hGH tư tuyên yên ngươi.

- 1956, hGH tach tư nao bo, cưu, … dung đê chữa bênh lun ơ trẻ em.

- 1972, câu truc phân tư cua hGH đươc xac đinh- 1985, hang Genetech san xuât thanh công hGH

co tên Protropin.

• Hormon sinh trương ngươi hiên nay chu yêu san xuât băng phương phap tai tô hơp gen. Co nhiêu san phâm thương mai giup điêu tri bênh hay giup cho phat triên cơ băp.

• hGH la protein nhỏ, co 191 a.a. Trong phân tư co 2 liên kêt disulfit

• Cac gen ma hoa hGH cua ngươi, bo… chuyên vao đông vât như ca, lơn,…tao đông vât chuyên gen phat triên nhanh.

Human Growth Hormone (HGH) (somatotropin)

• HGH promotes overall body growth by increasing amino acid uptake by cells, protein synthesis and fat

utilization for energyInsufficient production of HGH by the pituitary gland = dwarfism

– Chubby face– “Baby fat” around waist– Unusual body properties as an adult– ~ 4 feet tall only– IQ = Normal

HGH helps undersized children reach their normal height and size

http://www.hopkinsmedicine.org/hmn/F01/photos/36.jpg

2.2 Câu truc gen ma hoa hormon sinh trương ngươi

• Ho gen co 5 gen ma hoa, năm trên canh dai NST thư 17, kích thước 66 kb

• Gen ma hoa hGH bi đôt biên hoặc rối loan, dẫn đên thiêu hut hormon sinh trương, gây hôi chưng lun bâm sinh

• Gen hGH co đoan trinh tư ma hoa chuôi peptid tín hiêu không tương thích promoter cua E.coli, do đo biêu hiên gen hGH tai tô hơp trong E.coli rât yêu hoặc không hoat đông

2.3 Công nghê san xuât hormon sinh trương ngươi TTH

Bao gồm cac bước- Tach chiêt va tinh sach mRNA tư tê bao thuy trước

tuyên yên va thưc hiên ky thuât phiên ma ngươc- Sư dung enzym giới han căt bỏ đoan gen ma hoa 23-24

a.a cua chuỗi peptid tín hiêu- Chuyên gen ma hoa hGH vao vector biêu hiên thích hơp- Biên nap vector TTH vao E.coli, nuôi cây, thu sinh khối,

tach chiêt va tinh sach hGH- Tê bao biêu hiên: vi khuân, baculovirus, nâm men, tê

bao trưng chuôt

Pressure to use HGH to stimulate growth in youngsters who have no deficiency

but whose parents want them to grow up tall.

In the summer of 2003, the U.S. FDA approved the use of human growth hormone (HGH) for

• boys predicted to grow no taller than 5′3″ and

• for girls, 4′11″

even though otherwise perfectly healthy. If adult suffers with hypopituitarism,

HGH therapy is also available as normally payable under an insurance policy.

Pre-recombinant era of HGH production

HGH could be purified from cadaver (tử thi) pituitary glands

8 cadavers/year for 8 – 10 years per patientCreutzfeldt-Jacob Disease (CJD) is one of the risk of using brain tissue

24 cases reported by 1993 in France from cadaver HGH

Protropin (Genentech) and Humatrope (Eli Lilly)

Native human GH contains signal peptide needed to direct nascent polypeptide to RER in

eukaryotesSignal peptide is bad for E.coli

(it can not synthetize this protein)

Signal sequence removed be EcoRI cleavageCoding sequence for first 24 aa also lost in the

process of removal24 amino acids added back by synthetic DNA linker

Expressed in E. coli successfully

hGH therapy is very expensive, costing anywhere from $800 to $2,500 a month

3. San xuât interferon tai tô hơp

3.1 Lươc sư nghiên cưu interferon- Năm 1930, phat hiên gia suc nhiễm bênh do môt

loai virus nay, ít bi nhiễm loai virus khac. Isaacs va Linderman (1957) khi nuôi cây phôi ga đa phat hiên 1 loai protein mới gây ưc chê tai ban virus, goi la interferon (IFN)

- Trước năm 1980, san xuât IFN tư tê bao bach cầu ngươi, lây nhiễm virus, sau đo nuôi trong phôi ga đê tê bao bach cầu sinh IFN Gia thanh đăt

- Thang 1 năm 1980 thanh công san xuât IFN băng con đương TTH trong E.coli

- Interferon la protein hoặc glycoprotein, TLPT – 16-45 kDa. Co tac dung ngăn can sư xâm nhiễm cua virus hoặc kim ham phat triên khối u.

- Interferon chia lam 2 nhom:Nhom 1: IFN α, IFN β, IFN ωNhom 2: IFN γ kem bên trong acid

• Interferons are small proteins released by macrophages, lymphocytes, and tissue cells infected with a virus. When a tissue cell is infected by a virus, it releases interferon. Interferon will diffuse to the surrounding cells. When it binds to receptors on the surface of those adjacent cells, they begin the production of a protein that prevents the synthesis of viral proteins. This prevents the spread of the virus throughout the body.

General Action of Interferons

• Three types of interferons: alpha, beta and gamma.

Type I Interferons

• Type I: alpha and beta

• Alpha interferons are produced by leukocytes

• Beta interferons are produced by fibroblasts

• Both bind to interferon cell receptors type 1 and both encoded on chromosome 9

•They have different binding affinities but similar biological effects

•Viral infection is the stimulus for alpha and beta expression

• Used to mobilize our 1st line of defense against invading organisms

•Largest group and are secreted by almost all cell types

Type II Interferon (gamma)• Bind to type 2 receptors and its genes are encoded on chromosome 12

•Initially believed that T helper cell type 1 lymphocytes, cytotoxic lymphocytes and natural killer cells only produced IFNg, now evidence that B cells, natural killer T cells and professional antigen-presenting cells secrete IFNg also.

• Gamma production follows activation with immune and inflammatory stimuli rather than viral infection.

• This production is controlled by cytokines secreted by interleukin 12 and 18.

IFN tai tô hơp• Interferons are broken down into recombinant versions of a specific interferon subtype and purified blends of natural human interferon.

• Many of these are in clinical use and are given intramuscularly or subcutaneously

• Recombinant forms of alpha interferon include:

•Alpha-2a drug name Roferon

•Alpha-2b drug name Intron A

•Alpha-n1 drug name Wellferon

•Alpha-n3 drug name AlferonN

•Alpha-con1 drug name Infergen

•Recombinant forms of beta interferon include:

•Beta-1a drug name Avonex

•Beta-1b drug name Betaseron

•Recombinant forms of gamma interferon include:

•Gamma-1b drug name Acimmune

How Does It Prevent Viral Replication?

virus

cells

(Other stimuli:exogenous ds RNA,LPS, bacterial components)

How Does It Prevent Viral Replication?

virus

interferon

How Does it Prevent Viral Replication?

virus

Inhibitoryproteins

No replication

3.2 Gen ma hoa ơ ngươi va cơ chê sinh IFN

• Trong tê bao ngươi IFN-α ma hoa bơi 22 gen năm trên canh ngăn cua NST số 9, gen ma hoa IFN-β năm trên NST số 2

• Gen ma hoa IFN-γ năm trên NST số 12, gồm 4 exon. San xuât trong tê bao lympho T

Vai tro cua IFN trong tri bênh do nhiễm virus

• Điêu tri viêm gan va ưng dung trong điêu tri ung thư

Infected Macrophage

T cell/NK cell

IFN

IL-12

IL-12R1

Tuberculosis susceptibility genes

NRAMP1

VDR

STAT1

Shown to be linked or associated with TB in more than one populationConflicting studies –both +ve and –ve associations with TB reportedSingle study shows association with TBNegative studies not shown – mostly not published!

IL-1TNFIL-10

HLA-DR2

YIFNR1

IFNR2

IL-12R2iNOS

Y

P2X7

Y

YYMBL

3.3 Công nghê san xuât interferon tai tô hơp

• San xuât IFN-α: gây nhiễm nhân tao virus vao tê bao bach cầu. Sư dung môt số loai virus như Sendal, Newcastle, λ

• San xuât IFN-β: tư nguyên bao sơi

4. San xuât yêu yêu tố VIII va IX tai tô hơp

• Cac chât co anh hương đên sư đông mau: tư I đên XII. Trong đo yêu tố VIII va IX đong vai tro quan trong.

5. San xuât vaccin tai tôi hơp va vaccin DNA

5.1 Lươc sư nghiên cưu va ưng dung - Năm 1780 Edward Jenner phat hiên

phương phap phong bênh đâu mua băng chung đâu với virus gây bênh đâu bo giam đôc lưc

- Luis Pasteur phat minh vaccin chữa bênh dai

- Co thê chia vaccin lam 2 nhom: truyên thống va tai tô hơp

ư

Smallpox - đâu muaVaccination

• Jenner 1796 : Cowpox/Swinepox

• 1800’s Compulsory childhood vaccination

• 1930’s Last natural UK case

• 1940’s last natural US case

• 1958 WHO program

• October 1977: Last case (Somalia)

Smallpox• No animal reservoir

• Lifelong immunity

• Subclinical cases rare

• Infectivity does not precede overt symptoms

• One Variola serotype

• Effective vaccine

• Major commitment by governments

• Vaccin truyên thống: la vi khuân hoặc virus sống đa lam giam đôc lưc. Nhươc điêm: thơi gian bao quan ngăn, kho bao đam an toan → tính đôc hồi lai

• Vaccin TTH: protein khang nguyên nhơ ky thuât DNA. Ưu điêm: gia thanh rẻ, sư dung rông rai chống cac bênh do vi khuân, ký sinh trung, viêm gan do virus

• Vaccin DNA co hiêu qua cao trong phong chống bênh hiêm nghèo (ung thư, AIDS,…)

5.2 Vaccin tai tô hơp

5.2.1 Vaccin TTH phong chống viêm gan- Khang nguyên bê mặt virus viêm gan B

(HBV) đươc san xuât trong nâm men S.cerevisae tư năm 1981. Băt đầu sư dung tư năm 1986

- Môt số san phâm vaccin phong chống HBV: Recombivax HB, Engeris B, Genhevac B,… đươc san xuât trong tê bao nâm men va vi khuân

The growth cycle of Hepatitis B

virus

Chu trình sinh trưởng của HBV

From Murray et. al., Medical Microbiology 5th edition, 2005, Chapter 66, published by Mosby Philadelphia,,

Figure 66-5

• HBV vaccin sư dung gen ma hoa protein vỏ. Protein khang nguyên HBsAg co kha năng tao khang thê miễn dich manh nhât.

• Gen ma hoa protein vỏ gồm 3 gen: Pre-S1ma hoa chuỗi peptid gồm 128 a.a, Pre-S2 ma peptid co 55 a.a va gen S ma hoa chuỗi peptid co 226 a.a

• Ngươi ta tach riêng hoặc tô hơp S, Pre-S1 va Pre-S2 đê tao tô hơp vaccin khac nhau

• Viêt Nam la nước co tỷ lê nhiễm HBV ơ mưc cao, viêm gan câp tính 37-49 %, xơ gan co HBV 47-87 %, ung thư gan co HBV 57-80%

Transcription of Hepatitis B virus

From Murray et. al., Medical Microbiology 5th edition, 2005, Chapter 66, published by Mosby Philadelphia,,

Note: HBeAg (E) is encoded in C region using different start codons and is not shown

Figure 66-6

New Methods

• Recombinant DNA

•Single gene (subunit)

S-antigen mRNA

cDNA

Express plasmid

S-antigen mRNA protein

Hepatitis B vaccine

raised in yeast

5.2.2 Vaccin tai tô hơp chống bênh sốt ret

• 300-500 nhiễm bênh hang năm, tư vong 1-3 triêu ngươi. Kí sinh trung do 4 loai co vong đơi va qua trinh lây nhiễm phưc tap

• Vaccin tư gen khang nguyên Pfs-25 đang đươc thư nghiêm. Gen Pfs-25 đươc tach dong tư Plasmodium falciparum ma hoa cho protein co TLPT 25 kDa

• Đa sư dung vaccin phong chống viêm nao, cum ga. Đang phat triên vaccin phong chống sốt xuât huyêt, HIV/AIDS

5.3 Vaccin DNA

5.3.1 Lươc sư nghiên cưu va vai tro cua vaccin DNA

- 1990 Wolff va cs thư nghiêm găn môt đoan DNA vao vector biêu hiên, sau đo đưa trưc tiêp vao tê bao sống Mơ ra triên vong mới phong chống bênh truyên nhiễm

- Bênh Gumboro do virus gây bênh trên ga. Năm 1996 nhiêu nghiên cưu TTH gen khang nguyên VP2 hoặc đoan gen VP3, VP4 tao vaccin DNA.

- Vaccin DNA gồm 2 loai: vaccin tâp hơp gen khang nguyên va vaccin tâp hơp gen sinh khang thê

- Vaccin co nhiêu ưu điêm: dễ dang thiêt kê, san xuât, bao quan

DNA Vaccines and HIV

• HIV could be prevented using DNA Vaccines

-By isolating the gene for a protein produced by HIV, a DNA Vaccine could be created and immunity for the protein and thus HIV could be established. People would then be able to be immune to HIV.

• Many experiments have been done

-Researchers have attempted to create many varying DNA Vaccines, but none have been entirely successful in humans.

• Envelope gene-A specific gene of HIV that could be used to

create a DNA Vaccine for HIV.

www.wellesley.edu

4

II. Sư dung ky thuât gen trong chân đoan va điêu tri

1. Sư dung ky thuât gen trong chân đoan va điêu tri ung thư do virus

- Ung thư vom hong do virus RBV (Epstein-Barr virus)

- Phat hiên 6 loai virus gây viêm gan nguyên phat (HAV, HBV, HCV, HDBV, HEV va HGV)

1.2 Ky thuât gen va ưng dung trong điêu tri ung thư

• Phương phap phô biên điêu tri ung thư dung vector liêu phap gen tư Paramyxovirus va kêt hơp xa tri

• Hơn 50% trương hơp ung thư ơ ngươi liên quan đên hoat tính gen p53

• Gen p53 co kích thước 23 kb, năm trên NST 17.• Gen p53 san xuât protein co TLPT 53 kDa, điêu

hoa qua trinh phân chia tê bao va kích hoat hiên tương chêt theo chu trinh (apoptosis)

Naked DNANaked DNA

Target Target CellCell

Therapeutic Therapeutic ProteinProtein

AAVAAV

Retrovirus/LentivirusRetrovirus/Lentivirus

AdenovirusAdenovirus

NucleusNucleus

Gene Therapy Principles

2. Chân đoan môt số bênh nhiễm trung băng PCR

• Chân đoan sớm ký sinh trung sốt ret: Plasmodium falciparum, P. vivax, P. ovale va P.malariae.

• Chân đoan nhiễm vi khuân lao Mycobacteria tuberculosis

• Chân đoan virus Dengue gây sốt xuât huyêt

4. Sư dung ky thuât microarray trong chân đoan bênh

• Mang (thuy tinh, nhưa) co kích thước nhỏ chưa mẫu do (300 ngan – hang triêu) cho phep chân đoan nhanh cac bênh liên quan vât chât di truyên (DNA, RNA)

Application

to signaling:

Fibroblasts

stimulated

with serum:

8600 genes.

Principle:

DNA microarrayExperimental approaches

5. Sư dung ky thuât gen trong chân đoan bênh nhiễm trung ơ vât nuôi

• Chân đoan môt số bênh thương gặp trên tôm: bênh đốm trăng do WSSV, coi do MBV, đầu vang (YHV)

The Asian pandemic WSSV

1993

1991/2

1993

1993

1993

1994

1999

6. Sư dung ky thuât gen trong chân đoan bênh cây trồng va thưc phâm

chuyên gen• Bênh heo xanh do Xanthomonas

• Phat hiên băp, ngô chuyên gen