Potencia Antibiotica 2011

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  • ENSAYOS MICROBIOLOGICOS EN PERSPECTIVAQ.F. MIRTHA ROQUE ALCARRAZMG EN MICROBIOLOGIA

  • ENSAYOS BIOLOGICOSEs definido como un procedimiento experimental donde la potencia de una sustancia desconocida es estimada por comparacion de su efecto en un sistema biologico con un estandar de potencia conocida.Bioensayo: ensayo en el cual el poder o potencia de una sustancia es medido a travs de la respuesta de organismos vivos o sistemas vivientes.

  • Ensayo MicrobiologicoEl sistema biologico es un cultivo de microorganismos.

  • Ensayo MacrobiologicoEl sistema biologico es un numero de organismos superiores tales como:AvesMamiferos (ratas ,ratones etc)Organos aislados de animales

  • VariabilidadEl que se tenga que utilizar seres vivosCaracteristicas especialesQue sin excluir la BioeticaVariabilidad de los efectos que se obtienen es mayor que en los ensayos de la fisica o quimicaObliga el uso de metodos estadisticosLos resultados se acompaan de Limites de confianza.

  • Tipos de BioensayosDirectoDetermina la dosis o concentracion capaz de producir el efecto deseadoDosaje de digitalicosIndirecto basado en respuestas cualitativasDetermina la respuesta deseada en grupos de animalesDL50 dosis letalDosis efectiva 50

  • Ensayo IndirectoBasado en respuestas cuantitativas.Se compara los efectos de una sustancia conocida usado como patron o estandar con los de una muestra.Establece una relacion dosis/respuesta y la ecuacion de regresion correspondiente.Ensayos microbiologicos:Inhibicion de crecimiento bacteriano por sustancias antibioticasPromocion de crecimiento por sustancias como aminoacidos y vitaminas

  • HISTORIALa Penicilina se descubrio en 1929.En 1939 empieza la investigacion para la produccion de penicilina y otras sustancias antibioticas.Norman Heatley un bioquimico fue asignado para establecer las condiciones de produccion de penicilina.En 1940 Heatley ideo el ensayo de difusion en agar para penicilina.Heatley la describi en 1944 El mtodo en placa cilndrica descrito por Edwar Penley Abraham en 1941 para la prueba de penicilinas fue el primero.Ms tarde lo modificaron Foster y Woodruft asi como Schmidt y Moyer.A partir de 1971 la USP estandariz el mtodo

    ENSAYO DE POTENCIA ANTIBITICA

  • POTENCIA ANTIBIOTICALa ACTIVIDAD (POTENCIA) de un antibitico es estimada comparando la inhibicin de crecimiento de micro-organismos sensibles producida por concentraciones conocidas del antibitico que esta examinndose y una sustancia de referencia.( ESTANDAR DE REFERENCIA)

  • Bajo las condiciones adecuadas, la actividad POTENCIA de los antibioticos puede demostrarse por su efecto inhibidor sobre los microorganismos.La reduccion de la actividad antimicrobiana tambien revela cambios sutiles no comprobales mediante metodos quimicos Valoraciones microbiologicas siguen siendo la metodologia que permite disipar dudas en cuanto a la posible perdida de actividad de un antibiotico JUSTIFICACION

  • CONDICIONESAMBIENTEASEPTICO que permita que los procedimientos se realicen en condiciones de higiene que aseguren la no contaminacion No es necesario realizar el ensayo en una cabina de Bioseguridad.Cumplir con las BPLControl microbiolgico del rea de trabajoAsignar un area especifica para los ensayos de valoracion microbiologica

    AREA ASEPTICA

  • EQUIPOSTodos los equipos deben limpiarse bien antes y despues de cada uso.Los equipos que lo requieran deben ser calibrados.Los procesos de esterilizacion en horno y autoclave deben ser validados.

  • EQUIPOSBalanza analticaEspectrofotmetroIncubadoraBao termostticoHalmetroVernier digitalVortexRefrigeradora

  • EspectrofotometriaSe requiere un espectrofotometro adecuadoFuente luminosa que permita longitudes de onda 530 a 580 nm.la espectrofotometra visible solamente usa el rango del campo electromagntico de la luz visible , de 400 a 800 nm.

    Medir T o AMet. TurbidimetricoConc. Inoculos

  • Materiales de vidrioLos materiales de vidrio utilizados para conservar y transferir los organismos de prueba debenSer esterilizados por calor seco (Horno de esterilizacion) o calor humedo( autoclave)El material de vidrio graduado debe ser calibrado

  • Placas PetriDenominadas placas de valoracion (USP 32)Pueden ser de vidrio o plasticoDimensiones 20 x 100 mmDeben ser nuevas sin defectos ni rayadurasTener un procedimiento de lavado adecuadoSe utilizan esteriles

  • PLACAS PETRIDebern utilizarse placas de vidrio o desacartables con dimensiones de :20 x 100 mm100 mm diametro

  • Otros materialesMicropipetasVolumenes ;10 a 50 ul100 a 1000 ulDeben ser calibradas

  • CALIBRACION DE BALANZASe requiere que el procedimiento de pesada sea exacto.Al pesar sales para las soluciones tamponPesar sustancias antibioticas problemaSustancias estandar de referencia.

  • CONTROL DE TEMPERATURASe requiere control termostatico en varias etapas de una valoracion:Cultivo de microorganismosPreparacion del inoculoIncubacion de placas del ensayo de valoracionEs imperativo un control estricto diario de la TValoracion 0.5 CEstufas con circulacion de aguaMayor capacidad termica y T mas estable

  • Cilindros para valoracionCilindros de acero inoxidable o porcelanaDiametro externo de 8 mm.Diametro interno de 6 mmLongitud 10 mm

  • Tubos de prueba para turbidimetriaTubos de prueba de vidrio o plastico16 x 125 mm18 x 150 mmNo deben tener rayaduras ni defectosProcedimiento de lavado que elimine residuos de antibioticoSe deben esterilizar antes de usar y luego de usados antes de la limpieza.

  • MEDIOS DE CULTIVOSe encuentran en el mercado en forma deshidratada y se preparan de acuerdo a lo indicado por el fabricante.La USP indica los medios para cada antibitico.Deben pasar por la prueba de promocin de crecimiento, y la prueba de esterilidad. USP 32

  • Medios de cultivoLos medios de cultivo deben tener certificados del proveedor.En lo posible se debe trabajar con medios de un mismo laboratorio .

  • Medios de cultivo certificadosLaboratorios certificadosFormulas para reconstituirPreparan por ingredientes

  • SOLUCIONES AMORTIGUADORASSon soluciones de sales de fosfato de potasio.

    Otorgan el pH optimo para la actividad del antibitico durante la realizacin de los ensayos.

    La USP indica la solucin amortiguadora para cada antibitico.

  • Preparacin de las soluciones amortiguadorasUtilizar sales qumicamente puras y conservarse en el desecador.Las pesadas debern ser exactas.Debera utilizarse material estril (fiolas, pipetas, agua destilada y otros)Las operaciones de la disolucin se harn aspticamente.Las soluciones tampon se esterilizan por filtracion o se preparan con agua esteril.

  • IMPORTANTE RECORDARLa medicion del pHDe las soluciones tampon es un rquisito indispensable para la disolucion y difusion de las sustancias antibioticas

  • ESTANDARES DE REFERENCIA USPdenominados Estandares de Referencia OficialesSon sustancias de elevada purezaCon caracteristicas esencialesson sustancias cuya actividad ha sido precisamente determinada con: referencia a la Norma Internacional correspondiente o la Preparacin de la Referencia Internacional USP, BP.

  • USOAyudan a garantizar el cumplimiento de los requisitos de calidad oficiales de USP-FDASe utilizan en las valoraciones y pruebas farmacopeicas contenidas en las publicaciones de Nornas oficiales.

  • DistribucionLa USP ofrece mas de 2200 estandares de referenciaLa USP colabora con la OMS que tiene como objetivo proporcionar estandares biologicos internacionales y materiales quimicos de referencia para antibioticos,productos biologicos y quimioterapeuticos

    Productos

  • Uso correcto de los EstandaresLos Estandares de Referencia no estan diseadas para ser utilizadas como farmacos.Los usuarios deben asegurarse de la aptitud para el uso

  • AlmacenamientoDeben almacenarse en sus envases originales y cerradosLas condiciones de T y Humedad se indican en el certificado de cada Estandar.La exposicion a la luz es importante cuando la exigencia lo requiere.Desecadores

  • PesadaAsegurarse que los Estandares de Referencia sean pesados con exactitud

  • SecadoCuando sea necesario secar un Estandar antes de usarlo.Secar en un recipiente limpio y seco y No en el envase original.Seguir indicaciones especificadas en el certificado

  • MICROORGANISMOS DE PRUEBALas cepas a utilizar deben ser:Sensibles al antibitico de experimentacinResistentes a los dems antibiticos

    Deben ser adquiridas:American Type culture collection(ATCC)Deben ser conservadas en el medio indicado segn la USP.

  • American Type Culture Collection (ATCC)es una entidad privada, mundialmente reconocida como centro de recursos biolgicos, cuya misin se centra en la produccin, conservacin, y distribucin de patrones de referencia de microorganismos.Mercado dirigido para la investigacin y laboratorios de control de calidad.La coleccin de microorganismos ATCC, incluye ms de 1800 cepas de bacterias de 900 gneros, as como 2000 diferentes tipos de virus vegetales y animales.

  • Organismos de prueba para cada antibiotico

  • PREPARACION DEL INOCULO

  • PREPARACION DEL INOCULOSeleccionar el medio de cultivo.Sembrar el m.o en agar inclinado x 24 h a 30-35CCosechar el crecimiento con 3 ml de S.S.F.

    Propagar en Frasco Roux incubando a 30-35 C x 24h.Cosechar con 50 ml de SSF.Estandarizar concentracin del inoculo

  • SUSPENSION 10 8 A 10 9 CELULAS /ml

  • Sembrar m.oCosechar m.o 3 ml ssfPropagarm.oEstandarizarConcentracioninoculoIncubacion35 C x 24 hIncubacion35 C x 24 h

  • Recordar :El crecimiento y la preparacion del microor