Protocolo Hemato 2013

Manual de Hematología. Dpto. Microbiología y parasitología. UNAN-León.

ÍNDICE

CONTENIDO PÁGINA

I. TOMA DE MUESTRA.............................................................................................................1

1. ANTICOAGULANTES USADOS EN HEMATOLOGÍA.................................................1

3. PUNCIÓN VENOSA............................................................................................................4

4. PUNCIÓN CAPILAR...........................................................................................................7

II. BIOMETRÍA HEMÁTICA COMPLETA................................................................................9

1. MICROHEMATOCRITO.....................................................................................................9

2. RECUENTO DE GLÓBULOS ROJOS...........................................................................11

3. RECUENTO DE GLÓBULOS BLANCOS.....................................................................13

4. RECUENTO DE PLAQUETAS.......................................................................................15

5. DETERMINACION DE HEMOGLOBINA.......................................................................18

6. RECUENTO DIFERENCIAL............................................................................................20

7. ÍNDICES CORPUSCULARES.........................................................................................30

III. HEMOSTASIA Y COAGULACIÓN.................................................................................32

1. TIEMPO DE SANGRÍA.....................................................................................................32

2. TIEMPO DE COAGULACIÓN.........................................................................................34

3. TIEMPO DE PROTROMBINA (TP)................................................................................36

4. TIEMPO PARCIAL DE TROMBOPLASTINA (TPT)....................................................39

IV. TINCIONES ESPECIALES..............................................................................................41

1. AZUL CRESIL BRILLANTE (RECUENTO DE RETICULOCITOS)...........................41

2. MÉTODO DE LA GOTA GRUESA PARA EL DIAGNOSTICO DE MALARIA........44

V. OTROS PRUEBAS...............................................................................................................49

1. VELOCIDAD DE SEDIMENTACIÓN GLOBULAR (VSG)..........................................49

2. CÉLULAS L.E....................................................................................................................52

VI. PREPARACIÓN DE REACTIVOS Y COLORANTES..................................................54

1. SOLUCIÓN DE TURK 2%...............................................................................................54

2. SOLUCIÓN DE HAYEN...................................................................................................54

3. SOLUCIÓN OXALATO DE AMONIO 1%......................................................................54

4. EDTA...................................................................................................................................55

5. CITRATO DE SODIO AL 3.8%.......................................................................................55

I


6. COLORANTE DE GIEMSA.............................................................................................55

7. COLORANTE DE WRIGHT.............................................................................................56

8. SOLUCIÓN SALINA FISIOLÓGICA AL 0,9%..............................................................56

9. SOLUCION AZUL CRESIL BRILLANTE......................................................................56

10. SOLUCIÓN DE AZUL DE METILENO FOSFATADO.............................................57

11. SOLUCIÓN ALCOHÓLICA DE GIEMSA..................................................................57

VII. BIBLIOGRAFÍA.................................................................................................................58

II


I. TOMA DE MUESTRA

1. ANTICOAGULANTES USADOS EN HEMATOLOGÍA.

Los anticoagulantes se utilizan para obtener plasma o muestras de sangre total

para estudiar las características morfológicas y realizar los recuentos celulares.

Deben intentar que las células sanguíneas a estudiar se encuentren en el estado

más parecido al fisiológico, como cuando se encuentran circulando por el torrente

sanguíneo. Para ello los anticoagulantes no deben alterar la morfología de los

leucocitos, el tamaño eritrocitario, no producir hemólisis e impedir la agregación

plaquetaria, posibilitando al mismo tiempo el máximo período de conservación de

la muestra.

La sangre tratada con anticoagulante debe procesarse lo antes posible, incluso

mantenida bajo refrigeración (4 ºC) si no pasan de las 2 horas. El tiempo máximo

entre la extracción de la sangre y su procesamiento depende del coagulante de

elección y no debe ser más de 4 horas, a excepción del anticoagulante EDTA

(etilendiaminotetracético) que puede ser hasta 24 horas (en refrigeración a 4 ºC).

EDTA (C10H16N2O8) o sal disódica, dipotásica o tripotásica del ácido

etilendiaminotetracético.

Actúa mediante un efecto quelante sobre el calcio (Ca++), impidiendo el proceso de

la coagulación al fijarlo. Este anticoagulante se utiliza fundamentalmente para la

realización de recuentos celulares, sobre todo en los autoanalizadores y permite

además la realización del hematocrito y del frotis sanguíneo hasta dos horas

después de la extracción de la muestra al mismo tiempo que impide la aglutinación

de las plaquetas. Las sales de potasio tienen la ventaja con respecto a la de sodio,

por ser más fácilmente solubles en sangre cuando las usamos a partir del

producto sólido, sin embargo , las tres sales afectan el tamaño del eritrocito,

1


especialmente después del almacenamiento de la sangre anticoagulada por

espacio de algunas horas. El International Council for Standardization in

Hematology (ICSH) recomienda la sal dipotásica como anticoagulante para

recolectar muestras sanguíneas destinadas al recuento y caracterización del

tamaño celular y especialmente cuando los valores del hematocrito se requieren

para la calibración de los contadores automáticos. El K2EDTA .2H2O posee un

peso molecular relativo de 404,1g; 1g quela 100 mg de calcio iónico y el pH para

una solución al 1% es de 4.8+/-1,0. La cantidad de EDTA dihidratado agregada a

la sangre debe ser de 1.5-2.2 mg/ml. de sangre total. Esta cantidad es un

compromiso entre la cantidad requerida para evitar la coagulación y la cantidad a

la cual se producen las alteraciones celulares.

Citrato trisódico, C6H5O7Na3.

Actúa impidiendo que el calcio se ionice, evitando así la coagulación. Se utiliza

para realizar las pruebas de Hemostasia en una proporción anticoagulante-sangre,

1:9; así como para la velocidad de eritrosedimentación en una proporción

anticoagulante-sangre, 1:4. El citrato sódico se utiliza a una concentración de

0.106 mol/l (31,3 g/L de C6H5O7Na3.2H2O).

Heparina sódica. Heparina de litio.

Es un anticoagulante fisiológico que actúa impidiendo que la protrombina se

transforme en trombina. Estructuralmente es un mucopolisacárido ácido. Los frotis

realizados con muestras sanguíneas anticoaguladas con heparina producen en las

tinciones panópticas un color azulado y una pseudovacuolización celular por lo

tanto no se lo recomienda para tal fin. La proporción adecuada es de 15-20 UI

(0.1-0.2 mg) de heparina por ml de sangre.

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2. CÓDIGO DE COLOR DE TAPONES.

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3. PUNCIÓN VENOSA

El método mas común y rápido para la obtención de muestras sanguíneas es la

venopunción. La venopunción consiste en perforar una vena superficial con una

aguja hipodérmica, la sangre es colectada dentro de una jeringa o tubo con

anticoagulante.

La venopunción es una técnica que involucra la aplicación de las normas de

bioseguridad para reducir el riesgo de pinchazos accidentales, salpicaduras, que

pudieran perjudicar la salud del flebotomista.

Materiales y equipos requeridos

Algodón.

Alcohol al 70%.

Ligadura o torniquete.

Jeringas de 5 mL o 10mL.

Agujas Agujas 21Gx 1 ¼” (32x8).

Agujas 22Gx1.

Tubos con anticoagulante EDTA.

Caja para descartar material cortopunzante.

Obtención de la muestra

1) Verificar que los elementos por utilizar estén listos, y que el paciente se

sienta cómodo.

2) Aplicar el torniquete aproximadamente cuatro dedos por encima de la

flexión del codo o a 10 cm del codo, sujetar con un medio nudo.

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3) Limpiar la zona con alcohol al 70% o alcohol yodado, en un área de 2

pulgadas.

4) El paciente deberá abrir y cerrar la mano durante unos segundos y después

la mantendrá cerrada, esto ayudará a visualizar las venas superficiales

(Cefálica. Basílica y Mediana Cubital) o palpar la vena si no es posible

observarla.

5) Se retira el estuche protector de la aguja y se coge la jeringa de tal manera

que el bisel se encuentre hacia arriba.

6) Se fija la vena y se coloca la aguja en dirección paralela a esta, se perfora

la piel haciendo avanzar la aguja 0,5-1 cm en el tejido subcutáneo, hasta

perforar la vena.

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7) Se aspira la jeringa hasta el volumen requerido.

8) Retirar el torniquete e indicar al paciente que deje de hacer puño. Se coloca

el algodón seco encima de la punción y se retira la jeringa.

9) Retirar la aguja de la jeringa. Verter la muestra lentamente por las paredes

del tubo con anticoagulante.

10) Mezclar suavemente el tubo para homogeneizar la muestra con el

anticoagulante.

Ventajas de una extracción de sangre venosa

Pueden hacerse repetidos exámenes con la misma muestra.

Parte de la muestra (plasma o suero) puede congelarse para referencia

futura.

Desventajas de una extracción de sangre venosa

La punción venosa, por su largo procedimiento, requiere mayor preparación

que el método capilar.

El método es técnicamente difícil en niños, individuos obesos y pacientes

en shock.

Recomendaciones

La hemólisis debe ser evitada, pues se puede obtener una disminución en

el recuento de eritrocitos.

Debe evitarse prolongada estasis venosa producida por el torniquete, pues

produce hemólisis y otros cambios que ponen la sangre en un estado

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inadecuado para el análisis de gases, recuentos celulares, determinación

de pH sanguíneo y algunas pruebas de coagulación.

La sangre anticoagulada si no es de obtención reciente no debe ser

utilizada en extensiones de sangre, pues algunos anticoagulantes producen

cambios en las plaquetas que pueden causar aglutinaciones, agregación

plaquetaria y dificultan la identificación de leucocitos.

Puesto que algunos de los componentes de la sangre no son estables, los

recuentos de leucocitos y plaquetas e índice de sedimentación deben

realizarse antes de que pasen dos horas desde que se obtuvo la muestra.

4. PUNCIÓN CAPILAR

La sangre capilar es la obtenida por punción cutánea. Es una mezcla de sangre

procedente de arteriolas, vénulas y capilares con líquidos intersticiales e

intracelulares; su composición depende fundamentalmente de la cantidad de flujo

sanguíneo en la zona de punción y de la profundidad de penetración de la

lancetas.

Cuando la cantidad de sangre que se precisa es muy pequeña o cuando por

diferentes motivos no pueda practicarse una punción venosa, debe recurrirse a la

punción capilar.

Materiales

Algodón.

Alcohol al 70%.

Lancetas.

Capilares con heparina.

Capilares sin heparina (frotis sanguíneo).

Procedimiento

1) La sangre capilar se obtiene de la cara lateral del dedo medio o anular en

los adultos y del dedo gordo del pie o talón en los niños.

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2) Desinfectar la zona con alcohol al 70%, secar con algodón estéril.

3) Punzar la piel con una lanceta estéril desechable (2 mm de profundidad).

4) Usar gasa estéril para desechar la primera gota y recoger las siguientes en

tubos capilares. Evitar comprimir la extremidad para obtener sangre porque

se altera la composición sanguínea.

Ventajas

Puede obtenerse con facilidad.

Es preferible cuando han de realizarse extensiones de sangre periférica.

Desventajas

Sólo se pueden obtener pequeñas cantidades de sangre y los exámenes de

repetición requieren nuevas muestras.

La sangre en microtubos (capilares) frecuentemente se hemoliza

interfiriendo con la mayoría de pruebas de laboratorio.

Los resultados obtenidos en pruebas con sangre capilar no pueden ser

comparados con los resultados de las pruebas con sangre venosa.

El dedo no sólo es delicado sino difícil de desinfectar adecuadamente en el

tiempo disponible.

En pacientes con resistencia disminuida a la infección (aquellos con

leucemia, agranulocitosis, diabetes, uremia y enfermedades con

deficiencias inmunológicas), una muestra tomada del dedo es mucho más

probable que conduzca a una infección que otra tomada del brazo.

El recuento de eritrocitos y leucocitos, así como el recuento de plaquetas y

reticulocitos, no debe realizarse en sangre capilar debido a la difícil

estandarización del flujo sanguíneo capilar.

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II. BIOMETRÍA HEMÁTICA COMPLETA

1. MICROHEMATOCRITO

Fundamento

El hematocrito se basa en la separación de los elementos celulares del plasma

mediante centrifugación. Después que la sangre es centrifugada en un tubo

capilar, las celulas rojas se desplazan hacia al fondo del capilar, las celulas

blancas y plaquetas forman una pequeña capa por encima de las celulas rojas, y

el plasma conforma la capa superficial.

Se determina midiendo la fracción que comprende a los glóbulos rojos (masa

globular), respecto al volumen total de la muestra de sangre venosa o capilar,

reportado en porcentaje.

Materiales

Capilares con heparina

Capilares sin heparina.

Microcentrífuga.

Lector de Microhematocrito.

Sera selladora.

Mechero con metanol.

Procedimiento:

1) Tomar la muestra en capilares rojos heparinizados directamente del pulpejo

del dedo, o utilizar capilares azules sin heparina para sangre venosa con

anticoagulante EDTA.

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2) Debe llenarse aproximadamente 3/4 del capilar. El Llenado se efectúa por

capilaridad y se realiza poniendo en contacto uno de los extremos del tubo

capilar con la gota de sangre, o introduciéndolo en el tubo de sangre e

inclinando este, posteriormente, para facilitar el proceso.

3) Ocluir (tapar) un extremo opuesto del capilar con plastilina o calor

(mechero).

4) Colocar el capilar sobre la plataforma del cabezal de una centrífuga de

microhematocrito, con el extremo ocluido adherido al reborde externo de la

plataforma.

5) Centrifugar por 5 minutos entre 10 000 - 12 000 rpm.

Resultados (lectura)

La lectura se realiza con una escala estandarizada que expenden en el comercio.

Valores de referencia

Hombres 40% - 50%

Mujeres 36% - 48%

Niños (5 años) 34% - 42%

Lactantes (3 meses) 37% - 42%

Recién nacidos 51% - 60%

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Nota:

Se debe homogenizar las muestras para asegurar la calidad del ensayo.

Cada muestra debe montarse en duplicado; el segundo resultado debe de

variar entre ± 2%.

Si el resultado varía fuera de ± 2%, deberá repetirse el ensayo.

Al realizar la lectura del hematocrito solo incluir la capa de glóbulos rojos.

2. RECUENTO DE GLÓBULOS ROJOS

La sangre se diluye en un líquido que nos permite observar claramente los

hematíes, luego esta dilución se coloca en una cámara de Neubauer con la ayuda

de una pipeta automática o pipeta Pasteur y se cuentan en el microscopio a un

objetivo de 40x para calcular el número de glóbulos rojos por mm3.

Procedimiento (dilución 1/200):

1) Rotular los tubos y agregar 3980µl de solución de Hayem.

2) Una vez obtenida la sangre con anticoagulante o sangre capilar del dedo,

se procede a aspirar 20µl de sangre con la pipeta y limpiar la punta con

papel absorbente.

3) Depositar la sangre en el tubo que contenga solución de Hayem y mezclar

suavemente por inversión de 8 a 10 veces.

4) Monte el cubreobjetos en la cámara de Neubauer (debe estar limpia y

seca).

5) Mezclar la dilución manualmente y depositar 10µl en una de las ranuras de

la cámara de Neubauer.

6) Deje reposar por espacio de 3 minutos para que las células se sedimenten.

7) Enfocar con el objetivo de 10x y luego con 40x realizar el recuento:

cuadrante central y los cuatro angulares del retículo de Thomas.

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Cálculos:

# de Eritrocitos/mm3 =

Eritrocitos contados en 5 cuadrantes (R. Thomas)

Superficie contada x Profundidad x Dilución

Eritrocitos contados en 5 cuadrantes (R. Thomas)

1/5 x 1/10 x 1/200

Simplificando, obtenemos el factor de multiplicación:

# de Eritrocitos /mm3 = Eritrocitos contados x 10,000

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Dónde:

*Superficie contada= 0.2 mm2

*Profundidad de la cámara=0.1 mm*Dilución= 1/200


Valores de referencia.

(Millones de Eritrocitos/mm3).

Hombres 4 .5 - 5 .5

Mujeres 4. 0 - 5 .0

Niños (4 años) 4 .2 - 5 .2

Lactantes (1 - 6 meses) 3 .8 - 5 .2

Recién nacidos 5 .0 - 6 .0

3. RECUENTO DE GLÓBULOS BLANCOS

La sangre anticoagulada se deposita en un líquido que permite evidenciar los

leucocitos, manteniéndolos visibles, mientras que los eritrocitos son hemolizados.

El recuento del número de leucocitos o glóbulos blancos se expresa por mm3.


1) Rotular los tubos y agregar 380µl de solución de Turk.



papel absorbente.

3) Depositar la sangre en el tubo que contenga solución de Turk y mezclar en

un rotador automático por 2 ó 3 minutos.


seca).

5) Mezclar la dilución en el rotador automático y depositar 10µl en una de las

ranuras de la cámara de Neubauer.

6) Deje reposar por espacio de 3 minutos para que las células se sedimenten.

7) Enfocar con objetivo de 10x y contar en 4 cuadrados grandes angulares.

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Lectura.

Se realiza en los 4 cuadrantes. Además de los leucocitos contados dentro de cada

uno de los cuadrantes, se deben contar todos los leucocitos que se encuentren

adheridos en la línea horizontal superior y vertical exterior (en forma de L) o de lo

contrario, todos los leucocitos, adheridos a la línea horizontal inferior y vertical

interior.

Cálculos:

# de leucocitos/mm3 =

leucocitos contados en 4 cuadrantes


= leucocitos contados en 4 cuadrantes

4 x 1/10 x 1/20


# de leucocitos/mm3 = leucocitos contados x 50

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Dónde: Superficie contada=

4 mm2

Profundidad de la cámara= 0.1 mm

Dilución= 1/20


Corrección de valores para restar eritrocitos nucleados:

Los normoblastos no se destruyen (lisis) en el líquido de dilución, por lo tanto

pueden observarse al realizar el recuento leucocitario y confundirse con los

leucocitos. Cuando se encuentran 10 ó más normoblastos por 100 leucocitos

contados en el diferencial el recuento leucocitario debe ser corregido usando la

siguiente fórmula:

La concentración del número de Normoblastos (por mm3) es:

Normoblastos/mm3 = # de normoblastos contados x Leucocitos/mm3

100 + # normoblastos contados

Leucocitos/mm3 Corregidos = Leucocitos/mm3 – Normoblastos/mm3

Valores Normales.

Adultos: 5,000 – 10,000 Leucocitos/mm3

Recién nacidos: 10,000 – 25,000 Leucocitos/mm3

Niños: 8,000 – 15,000 Leucocitos/mm3

4. RECUENTO DE PLAQUETAS

Las plaquetas son fragmentos del citoplasma del megacariocito, su vida media es

de 9.5 días, sus funciones principales son: coagulación y mantener la integridad

de las paredes de los vasos. El recuento de plaquetas se efectúa en sangre

obtenida de punción venosa anticoagulada con EDTA, y sometida a hemólisis por

acción de una solución hipotónica de oxalato de amonio en agua destilada.


1) Rotular los tubos y agregar 1980µl de solución de Oxalato de amonio al 1%.

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papel absorbente.

3) Depositar la sangre en el tubo que contenga solución de Oxalato de amonio

al 1% y mezclar en un rotador automático por 2 ó 3 minutos.

4) Dejar reposar por 15 minutos.


seca).

6) Mezclar la dilución en el rotador automático y depositar 10µl en una de las

ranuras de la cámara de Neubauer.

7) Deje reposar por espacio de 15 minutos en cámara húmeda y oscuridad.

8) Enfocar con el objetivo de 10x y luego con 40x realizar el recuento:

cuadrante central y los cuatro angulares del retículo de Thomas.

Cálculos:

# de Plaquetas /mm3 =

Plaquetas contadas en 5 cuadrantes (R. Thomas)


Plaquetas contadas en 5 cuadrantes (R. Thomas)

1/5 x 1/10 x 1/100

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Dónde:

*Superficie contada= 0.2 mm2

*Profundidad de la cámara=0.1 mm*Dilución= 1/100



# de Plaquetas /mm3 = Plaquetas contadas x 5,000


Primera semana de vida: 150 - 340,000 plaquetas/mm3

1 semana a 2 meses: 200 - 400,000 plaquetas/mm3

2 meses a adultos: 150 - 450 000 plaquetas /mm3

Causas de aumento (trombocitosis):

La trombocitosis puede ser secundaria a un estímulo medular inespecífico

(posthemorrágica o tras una crisis hemolítica), paraneoplásica o posquirúrgica.

Es especialmente importante la que se produce tras la esplenectomía.

La trombocitopenia esencial aislada es muy rara, pero puede aparecer

asociada a trastornos mieloproliferativos. En estos casos, las plaquetas pueden

ser funcionalmente inoperantes y cursar, paradójicamente, con hemorragias.

Causas de disminución (Trombopenia):

Es fundamental descartar que no se haya producido un error de lectura como

consecuencia de una agregación parcial de las plaquetas en la muestra

estudiada. Especialmente llamativos son los casos en los que existe una

agregación precisamente en presencia de EDTA, que es el anticoagulante

utilizado para mantener incoagulable la muestra de sangre en la que se ha de

realizar la lectura.

Las verdaderas trombopenias pueden obedecer a una causa central

(generalmente asociada a leucopenia y anemia), periférica (inmunológica,

secuestro, consumo) o mixta (vírica). La púrpura trombocitopénica idiopática es

relativamente frecuente.

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5. DETERMINACION DE HEMOGLOBINA

Fundamento.

La hemoglobina es oxidada por la acción del ferricianuro a metahemoglobina y

mediante el cianuro se convierte en cianmetahemoglobina. La intensidad del color

formado es proporcional a la concentración de hemoglobina presente en la

muestra ensayada.

Materiales.

Micropipetas.

Agua destilada

Rotador automático

Tubos de ensayo 12x75mm.

Reactivo de hemoglobina

Espectrofotómetro.

Procedimiento.

1) Rotular los tubos de ensayo de la siguiente manera BLANCO (BL), y

Muestra (Mx).

2) Dispensar:

2.5 ml de H2O destilada 2.5 ml de H2O destilada + +

1 gota de Reactivo de Hb 1 gota de Reactivo de Hb +

10 µl de sangre/EDTA

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Hb

Mx

Hb

BL


3) Mezclar e incubar 3 minutos a Temperatura ambiente.

4) Seleccionar la prueba # 5 “hemoglobina/540 nm” en el espectrofotómetro.

5) Colocar el tubo de ensayo para la lectura del blanco y luego la muestra.

6) Anotar la concentración que está dada en g/dL.

Valores normales.

Edad g/dL

Recién nacido 13.5 – 19.5

Tres meses 9.5 – 12.5

1 año 11.0 – 13.0

3 a 6 años 12.0 – 14.0

10 a 12 años 11.5 – 14.5

Adulto (hombre) 14.0 – 18.0

Adulto (Mujer) 12.0 – 16.0

Interpretación de los resultados.

La hemoglobina es una proteína que contiene hierro, otorga el color rojo a la

sangre. Se encuentra en los glóbulos rojos y es la encargada del transporte de

oxigeno por la sangre desde los pulmones a los tejidos. Cuando el nivel de

hemoglobina aparece por debajo de los niveles normales indica anemia que puede

obedecer a diferentes causas: anemia primaria, cáncer, embarazo, enfermedades

renales o hemorragias.

Si el nivel de hemoglobina es alto puede deberse a cardiopatías, deshidratación o

estancia en lugares de gran altitud.

Notas:

Linealidad hasta 20 g/dL.

Usar anticoagulantes como EDTA, heparina u oxalato.

Estabilidad de la muestra: 1 semana a 2-8ºC.

6. RECUENTO DIFERENCIAL

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FROTIS SANGUINEO

La evaluación de un frotis sanguíneo es una parte rutinaria de la Biometría

Hemática Completa (BHC). Tinciones son aplicadas a los frotis sanguíneos para

que los elementos formes de la sangre (glóbulos rojos, glóbulos blancos y

plaquetas) puedan ser observados, identificados y evaluados usando en

microscopio como en el conteo diferencial.

Un frotis sanguíneo correctamente preparado permite al bioánalista clínico

observar los elementos formes de la sangre lo más cercano a su estado natural.

La morfología o estructuras de los elementos formes puede ser estudiada.

Partes del Frotis sanguíneo

Materiales

Láminas portaobjetos 25.4x76.2mm.

Láminas portaobjetos 25.4x76.2mm con bordes esmerilados.

Tubos capilares sin anticoagulante.

Micropipeta.

Procedimiento

1) Una vez extraída la sangre con cualquiera de las metodologías, se coloca

una pequeña gota de sangre (5µL) sobre un portaobjeto a 2 cm

aproximadamente de uno de los extremos.

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2) Colocar un extremo del portaobjeto esmerilado (portaobjeto extensor)

delante de la gota de sangre y desplazarlo suavemente hacia atrás hasta

alcanzar la gota para que se extienda por capilaridad.

3) Formando un ángulo de 45º, deslizar suave y uniformemente el portaobjeto

en sentido longitudinal, a velocidad moderada, hasta que la gota de sangre

quede bien extendida hasta 1 cm del extremo final del portaobjeto.

4) Secar el frotis a temperatura ambiente y en posición horizontal.

Frotis sanguíneo preparados inadecuadamente

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El grosor del frotis sanguíneo puede variar según sea el ángulo que formen entre

sí ambos portaobjetos.

Factores que afectan la calidad del frotis sanguíneo

La cantidad de sangre depositada en él portaobjeto.

El ángulo formado por la lámina extensora y el portaobjeto.

La velocidad de extensión de la sangre

Si es superior a 45º, la extensión obtenida será gruesa y corta, si es inferior a 45º

será larga y fina.

Notas:

La sangre con anticoagulante debe mezclarse antes de realizar el frotis

sanguíneo. Únicamente debe utilizarse anticoagulante EDTA porque otros

pueden alterar la morfología y las características de las celulas en la tinción.

El frotis sanguíneo debe realizarse dentro de 2 horas después de colectada

la muestra.

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Las láminas portaobjetos deben estar libre de grasa y polvo. Estas pueden

comprarse previamente limpias o lavar con agua y jabón, enjuagar con

agua caliente y posteriormente con agua destilada, por ultimo sumergir en

etanol al 95% y secar con una toalla libre de pelusas. Una vez limpias

pueden almacenarse en etanol al 95%.

TINCIÓN CON COLORANTE DE WRIGHT

Fundamento

Con el fin de estudiar satisfactoriamente los frotis sanguíneos, es necesario

colorearlos. En la mayoría de los laboratorios los colorantes más empleados para

la tinción hematológica se basan en el de Romanowsky constituido

fundamentalmente con la mezcla de eosina (ácido) y azul de metileno (básico).

Además se han incorporado el empleo de derivados por oxidación del azul de

metileno que se conoce con el nombre de azures (A, B, C). Son los azures los

responsables de la coloración púrpura o roja de ciertas estructuras.

Tanto la eosina como el azul de metileno son muy sensibles a las variaciones de

pH de las diferentes estructuras celulares, de forma que las que tienen carácter

básico fijan la eosina mientras que las que poseen propiedades ácidas fijan

principalmente el azul de metileno.

Esto explica que las estructuras basófilas se tiñan de color azul mientras que los

competente acidófilas adquieren un color rosado. La diferente afinidad de ciertas

granulaciones citoplasmáticas por dichos colorantes permite clasificar a los

leucocitos polimorfonucleares en 3 grupos:

Granulocitos eosinófilos, en los que la granulación específica contiene sustancias

de carácter básicos que fijan los colorantes ácidos y se tiñen de color rojo-naranja.

Granulocitos basófilos, en los que la granulación específica posee sustancias de

carácter ácido que fijan los colorantes básicos y se tiñen de color azul oscuro.

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Granulocitos neutrófilos, en los que la granulación específica posee compuestos

de carácter neutro por lo que fijan ambos colorantes simultáneamente, de ahí que

se tiñen de color pardo.

Dentro del grupo de colorante tipo Romanowsky los más utilizados son el de

Wright, Giemsa y May- Grünwald-Giemsa, entre otras.

Materiales

Colorante de Wright

Puente de tinción

Solución amortiguada tamponada (H20 destilada)

Pizeta

Papel filtro

Embudo

Beaker.

Algodón con alcohol.

Procedimiento

1) Una vez obtenido el frotis sanguíneo, se le dejará secar entre 15 y 20

minutos.

2) Luego se coloca la preparación en un soporte y se cubre con el colorante

de Wright, dejándolo por espacio de 4 minutos.

3) Posteriormente se añade solución amortiguada tamponada (H20 destilada)

en partes iguales hasta obtener un brillo metálico, dejando 4 minutos

adicionales.

4) Finalmente se lava con agua corriente, se deja secar y limpiar con un

algodón con alcohol el reverso de la lámina.

5) Se coloca en el microscopio y, con pequeño aumento, se revisa la calidad

de la coloración, la cantidad aproximada de glóbulos blancos y se escoge el

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sitio para iniciar el recuento. Se coloca una gota de aceite de inmersión y se

enfoca a un aumento de 100x.

Una extensión de sangre bien teñida debe caracterizarse por una buena

diferenciación de las estructuras subcelulares en los leucocitos, una coloración

rosada de los hematíes y la ausencia de precipitados.

Los defectos más frecuentes observados en la tinción del frotis sanguíneo son:

Coloración excesivamente azul, debido a:

Frotis excesivamente grueso.

Lavado insuficiente.

Tinción muy prolongada.

Empleo de colorante excesivamente alcalino.

Coloración con una tonalidad rosada: el colorante, el tampón o el agua de

lavado tienen un pH demasiado ácido.

Presencia de precipitados: obedecen a una acción excesiva del colorante.

Esto se puede evitar con la filtración.

RECUENTO DIFERENCIAL DE GLÓBULOS BLANCOS

Fundamento

El propósito del conteo diferencial es determinar el porcentaje de cada tipo de

celulas blancas en sangre periférica.

En la sangre se encuentran los leucocitos o glóbulos blancos que son las células

móviles del sistema inmunitario. Todos ellos difieren en cuanto a su función y

morfología. Los leucocitos no desempeñan sus funciones cuando se encuentran

en sangre, sino cuando abandonan ésta y entran a los tejidos linfoides o a las

zonas donde hay inflamación intensa. En este sentido, la sangre es un medio de

transporte, que le permite a las células sanguíneas recircular entre los diferentes

tejidos del cuerpo.

25


Normalmente en sangre se encuentran cinco tipos de leucocitos: monocitos,

linfocitos, neutrófilos, eosinófilos y basófilos. Además de estas células, se

encuentran presentes las plaquetas, que son fragmentos citoplasmáticos de los

megacariocitos que se asientan en la médula ósea.

Los leucocitos se estudian en preparaciones coloreadas por dos razones: a fin de

determinar la apariencia normal o anormal de las células y sus porcentajes

relativos en el diagnóstico de ciertas enfermedades.

Materiales

Microscopio óptico.

Contador manual para diferencial de celulas.

Aceite de inmersión.

Uso del objetivo de inmersion

Enfocar primeramente la lamina con el objetivo de menor aumento, rotar

ligeramente el objetivo hacia un lado. Colocar una gota de aceite de inmersion en

el portaobjeto justamente encima del condesador. El objetivo de inmersion ahora

es rotado cuidadosamente sobre la gota de aceite y la imágenes enfocada con el

tornillo micrometrico. El condensador se eleva al maximo, el diafragma se abre

completamente y se usa la luz maxima.

Lectura del diferencial

Se realiza en la zona donde los glóbulos rojos apenas se tocan entre si. Las

celulas se identifican más fácilmente en esta área debido a que tienen una forma

algo aplanada, lo que permite una mejor observación de los componentes

celulares.

26


El conteo diferencial se realiza al contar e identificar 100 glóbulos blancos y

reportando el porcentaje de cada tipo celular.

CARACTERÍSTICAS Y DIFERENCIACIÓN DE LOS LEUCOCITOS

CARACTERÍSTICAS Y DIFERENCIACIÓN DE LOS LEUCOCITOS

27


Cálculos:

Valores absolutos de glóbulos blancos cells/mm3=

28


Recuento total de glóbulos blancos cells/mm3 x % del tipo de glóbulo blanco

100

9,000 cells/mm3 x 60% neutrófilos segmentado

100

= 5,400 Neutrófilos segmentados/mm3

Estimación del Recuento Total de Leucocitos

Con el objetivo de 40x localizar la zona ideal de conteo, examinar 10 campos en

esta área y determinar el número promedio de leucocitos por campo y multiplicar

por 2,000.

Leucocitos/ mm3 = promedio de leucocitos en 10 campos x 2,000

Estimación de Recuento Total de Plaquetas

Con el objetivo de 100x localizar la zona ideal de conteo, examinar 10 campos en

esta área y determinar el número promedio de plaquetas por campo y multiplicar

por 20,000.

Plaquetas/ mm3 = promedio de plaquetas en 10 campos x 20,000


29


VALORES DE REFERENCIA DE

RECUENTO DIFERENCIAL (%)

VALORES

ABSOLUTOS

CELULAS/UL

Tipo de Célula 1 mes 6 años 12 años Adultos Adultos

Neutrófilos (seg) 15 -35 45-50 45-50 50-65 2,250 - 7,150

Neutrófilos (band) 7-13 0-7 6-8 0-7 0 – 770

Eosinófilos 1-3 1-3 1-3 1-3 45 - 330

Basófilos 0-1 0-1 0-1 0-1 0 - 110

Monocitos 5-8 4-8 3-8 3-9 135 - 990

Linfocitos 40-70 40-45 35-40 25-40 11,125 - 4,400

7. ÍNDICES CORPUSCULARES

Volumen corpuscular medio

Representa el volumen que, por término medio, tiene un hematíe. Mediante la

técnica clásica, el cálculo se realizara dividiendo el volumen globular comprendido

en 1 mm3 de sangre entre el número de hematíes contenidos en ese mismo

volumen.

VCM (fL)= Hematocrito (%) x 10

# Eritrocitos en millones/mm3.

VN: 82 – 94 fl

Hemoglobina corpuscular media

30


Es la proporción real de hemoglobina que corresponde, en promedio, a cada

glóbulo rojo en cifras absolutas. Relaciona la cantidad de hemoglobina con el

recuento de glóbulos rojos.

HCM (pg) = Hemoglobina (g/dl) x 10

# Eritrocitos en millones/mm3

VN: 27 – 32 pg

Concentración de hemoglobina corpuscular media

Es la concentración de hemoglobina por glóbulo rojo en porcentaje. Relaciona la

hemoglobina con el hematocrito. Expresa el tenor hemoglobínico en forma

porcentual respecto al paquete eritrocitario.

CHCM(g/dL) = Hemoglobina (g/dl) x 100

Hematocrito (%)

VN: 32 – 36 g/dL

Clasificación morfológica de las anemias.

31


III. HEMOSTASIA Y COAGULACIÓN

1. TIEMPO DE SANGRÍA

Fundamento

El tiempo de sangría prueba la función de las plaquetas y de los capilares

sanguíneos al medir el tiempo requerido para que una pequeña incisión en la piel

deje de sangrar.

Materiales

Algodón

Alcohol al 70%

Lancetas

Papel filtro

Cronómetro

Procedimiento

.

32

1. Limpie con suavidad el lóbulo de la oreja utilizando algodón embebido en alcohol al 70%.

2. Haga la incisión en el lóbulo de la oreja, al mismo tiempo cronometrar. Deje fluir la sangre sin exprimir el lóbulo de la oreja.

3. Después de 30 segundos. Recoja la primera gota de sangre en una esquina del papel secante. No toque la piel con el papel.

4. Espere otros 30 segundos y recoja la segunda gota de sangre.


Cálculo

Anote el tiempo transcurrido según el reloj, o contar el número de gotas recogidas

en el papel filtro y multiplicarlo por 30 segundos.

Redondee al medio minuto más cercano.

Valor de referencia

1 a 4 minutos.

Propósito de la prueba

33

5. Cuando las gotas de sangre dejen de fluir, detener el cronómetro.


Diagnosticar ciertos padecimientos hemorrágicos.

Antes de realizar operaciones quirúrgicas.

Antes de efectuar una punción en el hígado o el bazo.

Nota: No realizar la prueba en pacientes que han tomado aspirina en los últimos

8-10 días.

2. TIEMPO DE COAGULACIÓN

Fundamento

El tiempo de coagulación evalúa la función de los factores plasmáticos que

intervienen en la coagulación como la globulina antihemofílica, protrombina y

fibrinógeno, o que la dificultan como la antitrombina al medir el tiempo que tarda

en coagular una muestra de sangre venosa en un tubo de ensayo a 37 ºC.

Materiales

Algodón

Alcohol al 70%

Torniquete

Jeringa de 3 ml

Tubos de ensayo 12x75mm

Baño maria

Cronómetro

Procedimiento

34


Cálculos

Se notifica como tiempo de coagulación la media de los dos tubos.

Valor de referencia

5 a 10 minutos a 37 ºC.

Interpretación

35

1. Mediante una jeringa extraiga poco más de 3 mL de sangre venosa, Cronometrar el tiempo desde el momento que la sangre entre a la jeringa.

2. Llenar 2 tubos de ensayo con 1 mL de sangre. Taponar con algodón. Colocar en baño maría a 37 ºC.

3. Después de 3 a 5 minutos sacar el primer tubo del baño maría. Inclinar en posición horizontal en rotación a intervalos de 30 segundos hasta que la sangre coagule.

4. Examine el segundo tubo inmediatamente después que haya coagulado la sangre del primero, lo que por lo general es inmediato. Cronometrar.


El tiempo de coagulación está prolongado cuando hay severa deficiencia de todos

los factores de coagulación, excepto en la trombocitopenia y deficiencia de factor

VII o XIII. También está prolongado en presencia de heparina o anticoagulantes

circulantes endógenos. Un tiempo de coagulación normal no excluye un desorden

de la hemostasia.

3. TIEMPO DE PROTROMBINA (TP)

Fundamento.

Desde su descripción por Quick en 1935, el Tiempo de Protrombina (PT) o Tiempo

de Quick ha servido para determinar trastornos de la coagulación, la PT es la

determinación más frecuente junto con la APTT.

Mide el tiempo que tarda en coagular una muestra de plasma, desprovisto de

plaquetas y anticoagulado con citrato sódico, al ponerlo en contacto con una

suspensión de tromboplastina cálcica (sustituto de la tromboplastina tisular

fisiológica). Explora la vía extrínseca y común de la coagulación en las que

intervienen los factores I (fibrinógeno), II (protrombina), V, VII y X.

Es una prueba de gran interés y muy utilizada con fines de screening, diagnóstico

y control del tratamiento con anticoagulantes orales.

Materiales.

Suspensión de tromboplastina cálcica.

Plasma.

Micropipeta.

Cubeta con balín.

Incubadora.

Coagulometro.

Obtención del plasma:

36


Centrifugar la muestra a 1500 x g 15 min. y transferir el plasma a tubos de

ensayos.

Los plasmas turbios, ictéricos, lipémicos o hemolizados pueden dar

resultados erróneos.

La muestra es estable 2 horas a temperatura ambiente (15-25ºC) o 4 horas

a 2-8ºC.

Procedimiento.

1) El tubo conteniendo la tromboplastina cálcica debe ser incubado a 37 ºC

(dependiendo del volumen 5 a 10 minutos).

2) Encender y esperar que el coagulometro alcance su temperatura optima.

3) Aparecerá en la pantalla “0.0” lo que indica que el equipo está listo.

4) Agregar un balín y 100 uL de plasma del paciente en una cubeta.

5) Colocar la cubeta en la ranura central del coagulometro y poner a incubar

“incubation” 180 a 300 segundos.

6) Tomar con una pipeta 200 uL de tromboplastina cálcica y presionar “Start”,

el equipo realizara una cuenta regresiva de tres segundos. Cuando llegue al

último segundo agregar la tromboplastina cálcica en la cubeta.

7) Anotar la lectura y reportar en segundos.

8) Presionar “Start” para obtener el valor de INR.

Cálculos

Los valores se pueden expresar en segundos, pero se recomienda expresarlos en

Actividad porcentual (%), en Tasa de PT (PR), o en tasa internacional normalizada

(INR).

Tasa de PT (PR) = PT del paciente en segundos

PT de plasma normal (pool %) en segundos.

Índice Internacional de Sensibilidad (ISI).

37


La Tasa de PT (PR) se puede convertir a su correspondiente valor internacional

usando el índice internacional de sensibilidad (ISI). De esta manera se obtiene la

tasa normalizada internacional (INR): INR = PRISI


PT (segundos) 13-17 seg

PT (porcentaje) 70-120%

PT (tasa) 0,9– 1,2


El tiempo de protrombina es expresado en segundos con el valor del control (cada

cual es la media de pruebas duplicadas). El valor del control (y paciente) depende

de la tromboplastina y de la concentración del citrato y hematocrito. Un tiempo de

protrombina prolongado indica deficiencia de los factores II, V, VII o X también

está prolongado en la hipofibrinogenemia y heparinemia.

El tiempo de protrombina es utilizado como una prueba de despistaje y también

como control para pacientes anticoagulados con drogas antagonistas de la

vitamina K.

Notas:

No usar como anticoagulante oxalato sódico, EDTA o heparina.

Anticonceptivos orales, corticoides o terapias con anticoagulantes pueden

influir en los resultados.

4. TIEMPO PARCIAL DE TROMBOPLASTINA (TPT)

38


Fundamento.

Esta prueba determina anormalidades en los factores VIII, IX, XI y XII,

precalicreína y quininógeno (vía intrínseca de la coagulación) y factores II, V, X y

fibrinógeno (vía común de la coagulación).

La cefalina es un extracto de lípidos del cerebro, que funciona como un sustituto

de plaquetas. El sílice micronizado es usado como un activador de los factores XI

y XII. Cuando estos reactivos y el cloruro de calcio son agregados al plasma

citratado, los factores de la vía intrínseca son activados, el tiempo para la

coagulación del plasma se mide.

Materiales.

Plasma.

Micropipeta.

Cubeta con balín.

Incubadora.

Coagulometro.

Tromboplastina parcial (cefalina).

Cloruro de calcio 0,025 M.

Obtención del plasma:

Centrifugar la muestra a 1500 x g 15 min. y transferir el plasma a tubos de

ensayos.

Los plasmas turbios, ictéricos, lipémicos o hemolizados pueden dar

resultados erróneos.

La muestra es estable 2 horas a temperatura ambiente (15-25ºC) o 4 horas

a 2-8ºC.

Procedimiento.

39


1) La tromboplastina parcial y cloruro de calcio debe ser incubado a 37 ºC

(dependiendo del volumen 5 a 10 minutos).

2) Encender y esperar que el coagulometro alcance su temperatura optima.

3) Aparecerá en la pantalla “0.0” lo que indica que el equipo está listo.

4) Agregar un balín, 100uL de Tromboplastina parcial y 100 uL de plasma del

paciente en una cubeta.

5) Colocar la cubeta en la ranura central del coagulometro y poner a incubar

“incubation” 180 a 300 segundos.

6) Tomar con una pipeta 100uL de Cloruro de calcio y presionar “Start”, el

equipo realizara una cuenta regresiva de tres segundos. Cuando llegue al

último segundo agregar el Cloruro de calcio en la cubeta.

7) Anotar la lectura y reportar en segundos.


25 a 43 segundos.


El TPT es una prueba importante de despistaje, detectando las deficiencias más

insignificantes (debajo de 25% de los niveles normales) de los factores XII, XI, IX,

VIII, X, V. Esta prueba es mucho más sensible que el tiempo de coagulación para

la detección de estas deficiencias. Su utilidad más importante es en la detección

de las deficiencias congénitas de los factores VIII y IX. No detecta deficiencias del

factor plaquetario tres y factores VII y XIII. Esta prueba es útil en el monitoreo de

terapias con heparina.

IV. TINCIONES ESPECIALES

40


1. AZUL CRESIL BRILLANTE (RECUENTO DE RETICULOCITOS)

Los reticulocitos son glóbulos rojos inmaduros formados por ARN y protoporfirina

en el citoplasma.

Fundamento

Los reticulocitos contienen una fina red de ARN y protoporfirina que se puede teñir

con el azul de cresil brillante. Este colorante en combinación con una misma

cantidad de sangre anticoagulada se mezcla y con la ayuda de la temperatura

(baño maría) se produce la coloración de estos eritrocitos jóvenes visualizándose

en los frotis sanguíneos por microscopía.

Materiales y reactivos

Pipetas Pasteur 230mm


Baño maria

Láminas porta objetos 25.4x76.2mm (1”x3”).

Microscopio óptico

Azul cresil brillante

Aceite de inmersión

Procedimiento

1) En el tubo de ensayo colocar 3 gotas de sangre total con anticoagulante.

2) Inmediatamente adicionar con la ayuda de una pipeta Pasteur la misma

cantidad de Azul Cresil Brillante.

3) Mezclar la solución suavemente.

4) Se coloca luego en baño maría (37oC) por 15 minutos.

5) Se realizan frotis sanguíneos.

6) Se lee con objetivo de 100x.

41


Cálculos

Examine por lo menos 100 eritrocitos con el objetivo de inmersión. Cuente

cuidadosamente:

Cantidad total de glóbulos rojos.

Número total de reticulocitos que haya entre ellos.

El recuento se ha venido haciendo clásicamente de forma manual mediante la

observación en el microscopio óptico. El resultado se da en porcentaje sobre cada

100 hematíes. Es más útil calcular el número de reticulocitos por mm3, mediante la

fórmula:

Reticulocitos/mm3 = % reticulocitos x millones eritrocitos

100

Reticulocitos % = # de reticulocitos

10

Nota: Cuando disminuye el número de eritrocitos como suele suceder en la

anemia, el valor porcentual debe corregirse según el hematocrito empleando la

siguiente fórmula:

Reticulocitos corregidos (%) = reticulocitos observados (%) x Hto paciente

Hto normal

Existe una relación inversa, aproximadamente lineal, entre el hematocrito y el

período de maduración periférica de los reticulocitos. De esta forma puede

calcularse otra magnitud de interés clínico denominada índice de producción

reticulocitaria (IPR) aplicando la fórmula siguiente:

42


IPR = Reticulocitos del paciente x Hto del paciente

Período de maduración en días x Hto normal

Un IPR >3 indica aumento de actividad eritropoyética medular (anemia

regenerativa), mientras que un IPR <2 indica escasa actividad eritropoyética

(anemia arregenerativa)

Relación entre la respuesta reticulocitaria y el grado de anemia:

Hematocrito 45 40 35 30 25 20 15

Niveles de Hemoglobina (g/L) 15 13.3 11.7 11.0 8.3 6.6 5.0

Recuento de reticulocitos (%) 1 2 5 10 15 20 30

Recuento de reticulocitos

corregido (%)1 1,8 4 7 8,3 9 10

Tiempo de maduración

estimado 1 día 2 días 3 días

Índice de reticulocitos 1 2 5 5 7,5 10 10


Primeras 24 h de vida: 2,0 - 6,0%

1 día a 2 semanas: 0,3 – 1,5%

2 semanas a adultos: 0,5 - 2,2%

Variaciones patológicas

Disminución de la cifra de reticulocitos (reticulocitopenia)

43


Aplasia medular, anemias carenciales intensas (megaloblástica y ferropénica),

anemias inflamatorias.

Aumento de la cifra de reticulocitos (reticulocitosis)

Período neonatal, anemias hemolíticas, anemias posthemorrágicas, anemias

carenciales en fase de tratamiento, mieloptisis (infiltración neoplásica en la médula

ósea), mielofibrosis idiopática.

2. MÉTODO DE LA GOTA GRUESA PARA EL DIAGNOSTICO DE

MALARIA

La malaria es una infección parasitaria causada por una de las 4 especies del

genero Plasmodium, siendo la más mortal P. falciparum. En el laboratorio puede

ser diagnosticada mediante la identificación de las formas parasitarias en un frotis

sanguíneo.

Toma de muestra

1) Limpiar con un alcohol el dedo medio de la mano o dedo gordo del pie en

lactantes. Nunca debe hacerse en el dedo pulgar ni en los adultos ni en los

niños.

2) Puncionar con lanceta desechable el borde lateral del dedo. Limpiar la

primera gota de sangre con algodón seco.

3) Presionar para obtener una nueva gota de sangre y tomarla en el centro de

un portaobjeto. Presionar nuevamente para obtener más sangre y tomar

dos o tres gotas más grandes sobre el portaobjeto a un cm de distancia de

la gota tomada anteriormente.

4) Extensión en capa fina: utilizar otro portaobjeto limpio para hacer la

extensión. Tocar la gota pequeña con el segundo portaobjeto y realizar un

extendido periférico normal con ángulo de 45°.

44

La sangre debe ser colectada antes de empezar cualquier tratamiento.

La sangre capilar es el espécimen de preferencia, porque los anticoagulantes pueden alterar la morfología del parasito y las características de la tinción.


5) Preparación de gota gruesa: con la esquina del segundo portaobjeto. Unir

en movimientos rápidos las gotas de sangre más grandes y extender en

una capa gruesa y uniforme. La sangre no debe removerse en exceso pero

puede extenderse en círculo o rectángulo con 3-6 movimientos.

6) Dejar secar la preparación de gota gruesa en posición horizontal,

protegiendo el portaobjeto de las moscas, el l polvo y el calor excesivo.

45

1

2

4

5

6

Para permitir la deshemoglobinización, no debe fijarse la preparación de gota gruesa; así evite que esta quede expuesta al metanol o a sus vapores.


Tinción de extensión de sangre con colorante de Giemsa.

Método rápido de tinción de extensiones en capa gruesa y en capa fina sobre el mismo portaobjetos.

1) Fijar la extensión fina añadiéndole tres gotas de metanol o sumergiéndola en un recipiente con metanol durante algunos segundos.

2) Preparar una solución de Giemsa al 10% en agua amortiguada, destilada o desionizada, de pH 7,2; si se necesita poca cantidad, 3 gotas de colorante por ml de agua bastara para conseguir la concentración correcta de solución de Giemsa. Cada portaobjeto necesita unos 3 ml de colorante preparado.

3) Vertir suavemente el colorante sobre el portaobjeto; para ellos puede usarse una pipeta. Otra posibilidad es colocar los portaobjetos hacia abajo en un disco de tinción cóncavo e introducir el colorante por debajo del porta objeto.

4) Dejar actuar el colorante de 5-10 minutos. 5) Eliminar suavemente el colorante del portaobjeto añadiendo agua limpia

gota a gota; no debe inclinarse el portaobjeto para que caiga el colorante y lavar a continuación, ya que así quedará un depósito de espuma sobre la extensión.

6) Colocar el portaobjeto en la gradilla, con la cara de la extensión hacia abajo, para que escurra y se seque, asegurándose de que la extensión no toca el soporte.

Identificación de Plasmodium spp.

46


47


Recomendaciones

Si es necesario guardar las preparaciones de gota gruesa realice la precoloración antes de teñir:

Sumergir durante 1 segundo en azul de metileno fosfatado. Dejar escurrir sobre una toalla de papel. Después de esto se puede colorear inmediatamente o dejar secar en posición vertical. Las placas así tratadas se pueden guardar varios días.

Dilución y tiempo de tinción usando tinción de Giemsa comercial

Dilución Tiempo de tinción Como realizarla

1:20 20 minutos2 ml Giemsa +38 ml de bH2O

1:50 50 minutos1 ml Giemsa +49 ml de bH2O

1:100 2 horas1 ml Giemsa +99 ml de bH2O

V. OTROS PRUEBAS

1. VELOCIDAD DE SEDIMENTACIÓN GLOBULAR (VSG)

48


Fundamento

Cuando se deja una muestra de sangre anticoagulada en reposo, los hematíes

como tienen mayor densidad que el plasma, tienden a sedimentar, la velocidad de

caída depende de la tendencia que tienen los eritrocitos a formar pilas o “rouleaux”

y esta a su vez depende de la interacción de dos fuerzas opuestas: Una fuerza de

atracción: Las fuerzas de Van der Waals y una fuerza de repulsión: El potencial Z.

El equilibrio entre estas dos fuerzas puede ser alterado por la presencia de ciertas

moléculas asimétricas plasmáticas, especialmente el fibrinógeno (Proteína de fase

aguda) y las gamma globulinas cuando están muy aumentadas, estas proteínas

funcionan como dieléctricos disminuyendo el potencial Z, por lo tanto priman las

fuerzas de atracción y se acelera la velocidad de sedimentación.

Para la prueba, la sangre no debe coagularse, motivo por el cual, la sangre

extraída se le adiciona una sustancia anticoagulante (la más común es citrato

sódico al 3,8 % en proporción exacta de 1 parte de citrato por 3 de sangre, es

decir, al 1/4).

La sedimentación globular se realiza en tres etapas:

Hemaglutinación: Es la tendencia de los hematíes a formar agregados en

forma de "pilas de moneda". Estos sedimentan de forma muy lenta por lo

que van a determinar la velocidad de todo el proceso.

Sedimentación: Desplazamiento de los hematíes hacia el fondo de la pipeta

a velocidad constante.

Acumulo o depósito en el fondo.

El principio físico de esta prueba se basa en la Ley de Stokes considerando los

hematíes como esferas suspendidas en un medio infinito.

Materiales:

Tubos Wintrobe.

Pipetas Pasteur.

Soporte de Wintrobe.

Tabla de Wintrobe.

Cronometro.

49


Procedimiento:

1) Con la ayuda de la pipeta pasteur llenar el tubo Wintrobe hasta la marca de

10 o 1 con sangre previamente homogenizada.

2) Colocar el tubo de Wintrobe en la gradilla de sedimentación cuidando que

esté perfectamente nivelada (vertical, 90º).

3) Dejar reposar durante 1 hora evitando cualquier movimiento.

4) Hacer la lectura de los milímetros (mm) sedimentados en 1 hora.

Este es el resultado sin corregir y se reporta VSG sin corregir en mm/hr.

Corrección de los valores de VSG:

Se debe realizar la corrección de los valores de VSG a pacientes con anemia,

utilizando la tabla de Wintrobe, que relaciona el Macrohematocrito con el valor en

mm de la VSG.

1) Centrifugue por 30 minutos el tubo de Wintrobe y obtenga el valor de

Macrohematocrito.

2) En la tabla de corrección de VSG, ubique en el eje de la Y la VSG mm/hr y

en el eje de la X el valor del macrohematocrito.

3) Luego intercepte los puntos y descienda hasta la línea de la mujer y hasta

la línea del hombre, cuando alcance la línea que corresponda deténgase y

siga recto hasta encontrar el valor de la VSG corregida.

4) La escala de la VSG esta graduada de 2 en 2 y la escala del

macrohematocrito esta graduada de 1 en 1.

Factores que afectan a la VSG:

Factores Plasmáticos. Los más importantes son las proteínas

plasmáticas, especialmente el fibrinógeno y las globulinas (sobre todo alfa-

1-antitripsina, haptoglobina, etc...). La Albúmina posee un escaso efecto

sobre la VSG. Se cree que estas proteínas disminuyen la carga

electrostática de la membrana de los hematíes, disminuyendo la repulsión

entre ellos y favoreciendo su agregación.

50


Factores Físicos. Sobre todo la morfología eritrocitaria y el VCM,

observándose que a mayor tamaño de los hematíes, mayor velocidad de

sedimentación.

Factores Ajenos a la Sangre. Tales como temperatura, hemólisis, tiempo

transcurrido desde la extracción o limpieza de material


Los valores elevados pueden deberse a:

Causas Fisiológicas: Embarazo, Envejecimiento, Crecimiento normal

Causas Patológicas: Anemias intensas (especialmente microcíticas y

ferropénicas), Procesos Inflamatorios Crónicos, IAM (Infarto Agudo de Miocardio),

Insuficiencia Renal, Neoplasias, tumores y hemopatías, Gammapatías

Monoclonales, Aumento de la fracción de las globulinas.

Las causas más frecuentes de valores disminuidos:

Policitemias, Alteraciones eritrocitarias, e Hipofibrinogenenemia (disminución

concentración de fibrinógeno plasmático.

Valores Normales

Edad Hombre Mujer

Menor a 50 años < 15mm/hr < 20mm/hr

Mayor a 50 años <20 mm/hr <30 mm/hr

2. CÉLULAS L.E.

51


Fundamento

Se denomina célula LE a una célula fagocítica del sistema inmune que

ha fagocitado el material nuclear desnaturalizado de algún otro tipo de célula. Por

lo general esta célula fagocítica es un macrófago o un neutrófilo. El núcleo

desnaturalizado puede ser observado ocupando la porción central de la célula

fagocítica (esto es conocido como cuerpo LE), mientras que el propio núcleo de la

célula fagocítica por lo general queda extendido en forma de herradura en la

periferia. Las células LE fueron descubiertas en 1984 por Hargraves y

colaboradores.

Materiales

Mortero con pilón.


Pipeta Pasteur.

Colador.

Tubos Wintrobe.

Centrifuga.

Laminas portaobjetos 25.4x76.2mm (1”x3”).

Colorante de Wright.

Aceite de inmersión.

Microscopio óptico.

Incubadora.

Procedimiento

1) Extraer 10 ml de sangre y dejar coagular durante 2 horas a 37 ºC.

2) Centrifugar a 3,500 rpm por 10 minutos.

3) Eliminar el suero y depositar el coagulo en el colador, que está sobre el

mortero.

4) Aplastar el coagulo con el pilón y recoger el producto en el mortero.

52

http://es.wikipedia.org/wiki/Neutr%C3%B3filo

http://es.wikipedia.org/wiki/Macr%C3%B3fago

http://es.wikipedia.org/wiki/N%C3%BAcleo_celular

http://es.wikipedia.org/wiki/Fagocitosis

http://es.wikipedia.org/wiki/Sistema_inmune

http://es.wikipedia.org/wiki/Fagocito

http://es.wikipedia.org/wiki/C%C3%A9lula


5) Pasar el líquido obtenido a un tubo Wintrobe con la pipeta Pasteur, y

centrifugar 15 minutos a 2000 rpm.

6) Usando la misma pipeta Pasteur, eliminar primero el suero hemolizado, y

luego tomar la capa de leucocitos y depositar en dos láminas portaobjeto

para realizar el frotis.

7) Aplicar la Tinción Wright a los frotis.

8) Observar e identificar las células LE en las preparaciones usando el

microscopio a un objetivo de 100x.

Resultados

Se reporta “No se Observan Células LE” ó “Se Observan Células LE”

VI. PREPARACIÓN DE REACTIVOS Y COLORANTES

1. SOLUCIÓN DE TURK 2%

53


Ácido acético glacial…………………………………… 2,0 mL

*Solución acuosa de violeta de genciana al 1%........ 1,0 mL

Agua destilada…….……………………………………. 100 mL

*puede ser sustituido por 1 gota de cristal violeta.

Procedimiento

Se mezclan todos los reactivos y se guarda en frasco de vidrio en lugar fresco a

temperatura ambiente.

2. SOLUCIÓN DE HAYEN

Bicloruro de mercurio………………………………… 0,5 g

Sulfato de sodio ……………………………………… 5,0 g

Cloruro de sodio ……………………………………… 1,0 g

Agua destilada ………………………………………… 200 mL

Procedimiento



3. SOLUCIÓN OXALATO DE AMONIO 1%

Oxalato de amonio……………………………………… 1,0 g

Agua destilada c.s.p. …………………………………… 100 mL

Procedimiento



4. EDTA

EDTA en polvo………………………………………….. 8 g.

Agua destilada………………………………………….. 100ml

54


Procedimiento

Se mezcla el EDTA en el agua destilada.

5. CITRATO DE SODIO AL 3.8%

Citrato de sodio…………………………………………… 3,8 g

Agua destilada……………………………………………. 100 mL

Procedimiento

Se mezcla el citrato de sodio en el agua destilada.

6. COLORANTE DE GIEMSA

Colorante Giemsa en polvo …………………………….. 1,0 g

Metanol (CH3 OH) ……………………………………….. 66,0 mL

Glycerol ……………………………………………………. 66,0 mL

Procedimiento

1) Disolver el colorante con el glicerol.

2) Adicionar el metanol, mezclar bien y dejar a temperatura ambiente de 7 a

14 días (maduración).

3) Filtrar antes de su empleo. Guardar en frasco color oscuro.

7. COLORANTE DE WRIGHT

Colorante de Wright ………………………………………… 0,3 g

Metanol (CH3 OH) ………………………………………….. 97,0 mL

55


Glycerol ………………………………………………………. 3,0 mL

Procedimiento

Disolver en un mortero el colorante con el glicerol. Una vez disuelto se adiciona el

metanol trasvasándolo a un frasco oscuro (color caramelo), luego agite. Filtrar

antes de usar.

8. SOLUCIÓN SALINA FISIOLÓGICA AL 0,9%

Cloruro de sodio …………………………………………………… 0,9 g

Agua destilada c.s.p. ……………………………………………… 100 mL

Procedimiento



9. SOLUCION AZUL CRESIL BRILLANTE

Azul cresil brillante……………………………………………….. 1 g.

Citrato trisodico…………………………………………………… 0.4 g.

Solución de NaCl al 0.85%....................................................... 100ml

Procedimiento

10.SOLUCIÓN DE AZUL DE METILENO FOSFATADO.

Azul de metileno en polvo………………………………………… 1g

Fosfato disódico (NaHPO4)……………………………………….. 3g

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Fosfato monopotásico (KH2PO4)………………………………… 1g

Agua destilada…………………………………………………….. 300 ml

Procedimiento

Mezclar en mortero seco y disolver 1 g de la mezcla en 300 ml de agua destilada,

filtrar si es necesario.

11.SOLUCIÓN ALCOHÓLICA DE GIEMSA

Giemsa en polvo………………………………………………….. 0.75g

Alcohol metílico……………………………………………………. 65.0 ml

Glicerina pura……………………………………………………… 35.0 ml

Procedimiento

Preparar en botella con perlas de vidrio, la cual se mantiene bien tapada y agitar 6

a 10 veces diarias. Después de 3 días se puede usar, si los ensayos demuestran

que el colorante es satisfactorio; filtrar si es necesario.

VII. BIBLIOGRAFÍA

Rodak F. Bernadette. Hematología: Fundamentos y Aplicaciones Clínicas.

2a ed. Buenos Aires: Media Panamericana; 2004.

57


Ruiz Arguelles, G. Fundamentos de Hematología. 4a ed. México: Editorial

Panamericana; 2009.

Vives Corrons, J. Aguilar Bascompte, J. Manual de Técnicas de Laboratorio

en Hematología. 3a ed. España: ELSEVIER; 2006.

Barbara H. Estridge Anna P. Reynolds. Basic Clinical Laboratory

Techniques. 6th ed. USA: DELMAR CENGAGE Learning; 2012

Carr, Jacqueline H. Atlas de Hematología Clínica. 3a ed. Buenos Aires:

Médica Panamericana; 2010.

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Documents

Protocolo Hemato 2013