Terápiarezisztencia-fehérjéket kódolómRNS kvantitatív kimutatása PCR-

technikával lymphomás kutyák nyirokcsomójában

Sunyál Orsolya V. évfolyam

Témavezetık:Dr. Vajdovich Péter

Szabó Bernadett

SZIE-ÁOTK Kari TDK Konferencia, 2008.november 26.

A kutyák lymphomájáról általában

� bármely fajtában és ivarban, bármely

életkorban, de többnyire 9 év feletti kutyákat érint

� kezelése szinte kizárólag kemoterápiával

� a kutyákban elıforduló lymphoma az

emberek közepes vagy nagy malignitású

(medium ill. high-grade) ún. non-Hodgkin-

típusú lymphomájával mutat hasonlóságot

Lymphomás megbetegedések gyógyítása

kemoterápia multidrog rezisztencia

- felesleges és testidegen anyagok

az idegen anyagok sejtbıl valókijuttatásáért

különbözı fehérjék felelısek, ide

tartoznak pl. az ABC-transzporterek

MDR1 (Pgp= P-glycoprotein)

Fiziológiai szerepe:toxikus vagy sejtidegen molekulák transzportja

MDR1 által transzportált daganatellenes szerek:

aktiomicin Dmitomicin-Cmetotrexátmitoxantrontaxánok (paclitaxel, docetaxel)vinka-alkaloidok (vinkrisztin, vinblasztin)podofillotoxinok (etoposzid, teniposzid)antraciklinek (doxorubicin, daunorubicin, epirubicin)

Szöveti lokalizáció:bél, máj, vese,vér-agy gát here, placenta

www.csc.mrc.ac.uk/ResearchGroups/MembraneTransportProteinsAndDisease

MRP1 (multidrug resistance associated protein 1)

Fiziológiai szerepe:

� a tüdıben és a bélrendszerben mőködve a toxikus anyagokat visszapumpálja a lumenbe

� megakadályozza a toxinok felhalmozódását az agyban és a gerincvelıben kipumpálva azokat a vérbe

Szöveti lokalizáció:tüdı, here,vese, placenta, szívizom, gyomor, lép, vastagbél, pajzsmirigy

Szubsztrátjai:

antraciklinek , metotrexát, camptotecinek

Schaub et al.; J. Am. Soc. Nephrol. 6 1159-1169, (1999)

MRP2 (multidrug resistance associated protein 2)

MRP2 által transzportált gyógyszerek:

Daganat elles szerek:

ciszplatinmetotrexátvinka-alkaloidok (vinkrisztin, vinblasztin)antraciklinek (doxorubicin)podofillotoxinok (etoposzid)

Egyéb citotoxikus anyagok:

kolchicinnehézfémek

Szöveti lokalizáció:tüdı, bél, máj, vese,vér-agy gát, here, placenta

Fiziológiás szerepe:

a bilirubin-glukuronidok , az epesavas sók és a leukotriének transzportja

Jedlitschky et al.,; Expert Opinion Drug Metabol. Toxicol. 2. 351-366. (2006)

BCRP (Breast Cancer Resistance Protein)

Szubsztrátjai:antraciklinek, kampotecinek

Szöveti lokalizáció:Tüdı, bél, máj, endometrium, placenta, emlı, KIR (vér-agy gát), petefészek, here, érfal

Fiziológiai szerepe:

� védi a magzatot a toxikus hatásoktól

� az ıssejteket védi a hypoxiás sejthaláltól

� prooxidáns hemszármazékok transzportja

Gottesman et al.; Nature Reviews Cancer 2, 48-58. (2002)

Célkitőzés

� Vannak-e különbségek az általunk kialakított csoportok

között a transzporterek mennyiségét illetıen mRNS

szinten?

� Található-e összefüggés az mRNS-expresszió mértéke és a

lymphomás betegek klinikailag is megfigyelhetı terápiás

válasza között?

� Van-e az általunk vizsgált paramétereknek prognosztikai

értéke?

Anyag és módszer

�44 lymphomás kutya, III., IV., V. stádium,

és kontroll

�COPA kombinációs kemoterápiás

protokoll (ciklofoszfamid, vinkrisztin,

doxorubicin, prednizolon)

� 4 csoport: elsıdleges (n=33), recidívált

(n=7), szepszises (n=3) és kontroll (n=7)

Laboratóriumi analízis

� nyirokcsomók mőtéti kimetszése

� minták homogenizálása

� RNS-izolálás, DN-ázos emésztés

� cDNS írás, RT-q PCR

Csoportok közti vizsgálatok- MRP1, BCRP

MRP1-et vizsgálva jelentıs eltérés látható a kontroll és a szepszises csoport között

BCRP esetében szignifikáns különbség a kontroll és a szepszises, illetve a kontroll és a recidívált csoport között adódott

5E-04

5E-03

5E-02

5E-01

5E+00

mrp

1

norm

aliz

ált m

enny

iség

[g]

Median 25%-75% Min-Max

kontroll elsıdleges recidivált szepszis

p<0,05

5E-06

5E-05

5E-04

5E-03

5E-02

5E-01

5E+00

bcrp

n

orm

aliz

ált m

enny

iség

[g]

Median 25%-75% Min-Max

kontroll elsıdleges recidivált szepszis

p<0,05p<0,05

mrp

1 n

orm

aliz

ált

men

nyi

ség

/ µg t

ota

lRN

S

bcr

pno

rmal

izál

t m

enn

yisé

g / µg

to

talR

NS

Csoportok közti vizsgálatok- MDR1

MDR1: a kontroll csoport transz-porter mennyisége minden cso-portéhoz képest nagyobb

Az elsıdleges és a recidívált csoportot összehasonlítva, utóbbiban szig-nifikánsan magasabb MDR1 transz-porter mennyiséget mértünk.

5E-05

5E-04

5E-03

5E-02

5E-01

5E+00

mdr

1 n

orm

aliz

ált m

enny

iség

[g]

Median 25%-75% Min-Max

kontroll elsıdleges recidivált szepszis

p<0,05p<0,05

p<0,05p<0,05

md

r1 n

orm

aliz

ált

men

nyi

ség

/ µg t

ota

lRN

S

md

r1 n

orm

aliz

ált

men

nyi

ség

/µg t

ota

lRN

S

4E-04

6E-04

8E-04

2E-03

4E-03

6E-03

8E-03

2E-02

4E-02

Median 25%-75% Min-Max

elsıdleges recidivált

p<0,05

A Spearman-teszt eredményei (p<0,05)

� a teljes túlélési idı (TTI) szoros összefüggést mutatott az MDR1 és a BCRP mennyiségével (-0,72; -0,65)

� a recidívamentes túlélési idı (RTI) szintén szignifikáns összefüggést mutatott az MDR1 és a BCRP mennyiségével(-0,59, -0,59)

�a kor és az MDR1 mennyisége közt korrelációt találtunk (0,43)

TTI RTI Kor0 20 40 60 80 100 120 140 160

Teljes túlélési idı [hét]

0,0005

0,0050

0,0500

0,5000

5,0000

Nor

mal

izál

t men

nyis

ég [

g]

mdr1 bcrp

����BCRP����MDR1

0 10 20 30 40 50 60

recidivamentes túlélési idı [hét]

0,0005

0,0050

0,0500

0,5000

5,0000

Nor

mal

izál

t men

nyis

ég [

g]

mdr1 bcrp����BCRP����MDR1

3 4 5 6 7 8 9 10

kor [év]

0,0005

0,0050

0,0500

0,5000

5,0000

Nor

mal

izál

t men

nyis

ég [

g]

mdr1

����MDR1

Többszörös lineáris regressziós modell által meghatározott TTI értékek az ismert TTI-k függvényében

R² = 82%

a modellel megállapítható, hogy a TTI elıre jelezhetıaz MDR1 és a BCRP alapján

0 20 40 60 80 100 120 140 160

mért

0

20

40

60

80

100

120

140

160

jelz

ett

tréning teszt

Pareto diagram

,9999422

1,129041

3,051104

5,135259

p=,05

MRP 2

MRP 1

BCRP

MDR 1MDR1

BCRP

MRP1

MRP2

Összefoglalás

� az MDR1 fehérje fontos élettani szerepét bizonyítja a kontrollokban mért

magasabb expressziós szint

� a szepszis kialakulásának hátterében a csökkent rezisztencia állhat

� a terápia-rezisztencia megjelenése csökkenti az állat túlélési esélyeit

� vizsgálataink alapján a recidívált tumor már kevésbéérzékeny a kezelésre,

ennek ismeretében lehet csak a rezisztencia ellen tenni: pl. új protokoll

� a TTI-re 82%-os biztonsággal lehet elıre jelezni az MDR1 illetve BCRP

mennyisége alapján

� a módszer elınye: gyors információ, kis mennyiségő minta is elegendı

Köszönetnyilvánítás

Témavezetıim és

Dr. Szécsényi DóraJakus Judit, PhDDr. Gálfi PéterSzekér Krisztina, PhDCsizinszky Rita

Köszönöm a figyelmet!