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人类淋巴细胞培养 和染色体标本的制备遗传病的分析 3

原 理 在细胞的生长周期中，中期染色体的长短、大小、恒定性正适合我们对其进行分析、研究。 因此利用人工的方法，使大部分分裂细胞处于中期而不向后期转化，并获得之，经处理，制片后观察分析。

器材与试剂 器材 ： 人外周血 5ml。 培养箱、普通光学显微镜、离心机、水浴箱、天平等。 试管架、刻度离心管、滴管和滴头、酒精灯、冰载玻片等。

器材与试剂 试剂： 肝素 含 10% 小牛血清 RPMI1640 植物血凝素（ PHA ） 秋水仙素（ 5 微克 / 毫升） 0.075MKCl ， 固定液（甲醇 / 冰乙酸 3:1 ） Giemsa 染液。

操 作1 、采血： 取血 3-5ml, 肝素抗凝。2 、接种： 5ml 培养液中加入 0.3-0.5ml 全血并摇匀，每份血样接种 2 瓶，置 37℃, 培养 72h 。3 、秋水仙素处理：终止培养前 1.5-2h 加秋水仙素（终浓度为 0.07 ug/ml ），混匀， 37℃ 继续培养。4 、收集细胞 ：将培养细胞混匀吸入刻度离心管（ 2瓶培养物吸入 1 支刻度离心管内）， 1500r/min离心， 10min 。5 、低渗处理：弃上清，加 8ml 0.075M KCl 溶液，混匀，置 37℃ 水浴 20min 。

操 作6 、预固定 ：低渗处理后，加 1 ml 固定液混匀， 5min 后 1500r/min 离心， 10min 。7 、固定 ：弃上清，加 8 ml 固定液，混匀，室温静置

30min ， 1500r/min 离心， 10min 。8 、再固定 ：同上（省略）。9 、制备细胞悬液 ：弃上清，视细胞数量多少加适量固定液制成细胞悬液。10 、制片 ：取细胞悬液 2-3 滴，滴于冰玻上，并迅速吹片，酒精灯火焰烤干。11 、观察： Giemsa 染色， 5min ，自来水冲洗，镜检。

结 果

光镜 100倍下人染色体 G带照片

注意事项 培养温度应严格控制在 37℃±0.5℃ 。 培养液的 pH 值 7.4±0.1 ，偏酸细胞发育不良，偏碱则细胞出现轻度固缩。 PHA 的质量和浓度很关键，它对淋巴细胞的刺激效应有个体差异较大。 （肝素） 秋水仙素一般最终浓度以 0.04-0.08ug 为宜，处理时间为 1-4h 。 低渗的浓度与时间应掌握好。 固定液应临用时新鲜配制，固定时一定要彻底打匀。

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