免疫实验理论讲授

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免疫实验理论讲授

周艳王飞[email protected]

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主要内容

示范教学血清学反应单克隆抗体技术

本学期实验多克隆抗体的制备 T 淋巴细胞转化试验 NK 细胞毒活性的检测


血清学反应


血清学反应

抗原 (antigen) 是一类能刺激机体免疫系统产生抗体和 /或致敏淋巴细胞，并能与相应抗体或致敏淋巴细胞在体内外发生特异性结合而出现反应的物质。

抗体（ antibody ）指机体的免疫系统在抗原刺激下，由 B 淋巴细胞或记忆细胞增殖分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。主要分布在血清中，也分布于组织液及外分泌液中。

血清学反应：是体外发生的抗原抗体反应，根据可见的现象判定反应结果。

微生物鉴定传染病及寄生虫病诊断检测


二、血清学试验的特点（一）特异性和交叉性（二）敏感性（三）可逆性（四）反应的二阶段性（五）最适比例与带现象（六）用已知测未知

血清学反应


三、影响血清学试验的因素（一）电解质（二）温度（三）酸碱度（四）振荡（五）杂质和异物

血清学反应


血清学反应

三、血清学反应类型（一）凝集反应（二）沉淀反应（三）补体结合反应（四）中和反应（五）免疫酶标技术


血清学反应

凝集反应细菌、红细胞等颗粒性抗原，或吸附在红细胞、乳胶等颗粒性载体表面的可溶性抗原，与相应抗体结合后，在有适量电解质存在下，经过一定时间，复合物互相凝聚形成肉眼可见的凝集团块，称为凝集试验（ Agglutination test ）。参与凝集试验的抗原称凝集原，抗体称凝集素。参与凝集试验的抗体主要为 IgG 和 IgM 。凝集试验可用于检测抗体或抗原，最突出的优点是操作简便，便于基层的诊断工作。


血清学反应凝集反应的类型1 、直接凝集反应颗粒性抗原与相应抗体直接结合并出现凝集现象的试验称直接凝集试验。（ 1 ）玻片法（沙门氏菌、链球菌、血型鉴定）（ 2 ）试管法（布氏杆菌病诊断）2 、间接凝集反应将可溶性抗原 ( 或抗体 ) 先吸附于一种与免疫无关、一定大小的不溶性颗粒的表面，然后与相应的抗体 ( 或抗原 ) 作用，在有电解质存在的适宜条件下，所发生的特异性凝集反应，称为间接凝集试验（ 1 ）正向间接凝集反应（ 2 ）反向间接凝集反应（ 3）间接凝集抑制反应


血清学反应

（ 1 ）玻片法定性试验，在玻璃板或瓷片上进行。将含有已知抗体的诊断血清与待检悬液各一滴在玻板上混合，数分钟后，如出现颗粒状或絮状凝集，即为阳性反应。用已知抗体检测未知抗原。新分离的细菌的鉴定、血型鉴定等。

抗 A 抗 B

待测红细胞悬液

--O

++AB

+-B

-+A

抗B抗A诊断血清

血型

--O

++AB

+-B

-+A

抗B抗A诊断血清

血型


血清学反应（ 2 ）试管法定量试验，在试管中进行，用以检测待检血清中是否存在相应抗体和检测该抗体的效价（滴度），应用于临床诊断或流行病学调查。用已知抗原检测未知抗体。

1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 C

待测血清倍比稀释

已知抗原


血清学反应


沉淀反应可溶性抗原 (如细菌的外毒素、内毒素、菌体裂解液，病毒的可溶性抗原、血清、组织浸出液等 ) 与相应的抗体结合，在适量电解质存在下，经过一定时间，形成肉眼可见的白色沉淀，称为沉淀试验（ Precipitation reaction test ）。参与沉淀试验的抗原称沉淀原，抗体称沉淀素。

可溶性 Ag ＋相应 Ab 　肉眼可见沉淀物电解质

比例适当

血清学反应


沉

淀

反

应

环状沉淀反应

絮状反应

琼脂扩散单扩散

双扩散电泳

火箭电泳

对流免疫电泳+

血清学反应沉淀反应的分类


单扩散沉淀

即将定量的抗体混合于琼脂中，待琼脂凝固后打孔加入抗原，孔中的抗原向四周扩散，在抗原与抗体的比例合适处呈现白色的沉淀环。沉淀环的大小与抗原的浓度成正比，故该试验是定量试验。应用 : 广泛应用于兽医临床，如鸡马立克氏病诊断。缺点需要经 1～ 2天结果。

血清学反应


血清学反应双扩散沉淀即将抗原和抗体分别加入琼脂对应的孔中，二者会向四周扩散，在二者比例合适处形成白色沉淀线。应用 : 检测 AFP HBsAg, 协助疾病诊断 .


定义：即带电颗粒在电场的作用下向着相反的电极移动，称为电泳。

原理：大部分抗原在碱性溶液（ pH>8.2 ）中带负电荷，在电场中向正极移动；而抗体球蛋白带电荷弱，在琼脂电泳时，由于电渗作用，向相反的负极移动。

血清学反应


对流免疫电泳的原理蛋白质抗原在碱性环境中，其羧基发生电离而带负电荷，

在电泳时从负极向正极移动。抗体分子在电场中从正极向负极移动。

血清学反应


火箭免疫电泳单向扩散 +电泳：将单向扩散与电泳技术相结合的一种方法。

沉淀峰的高度与抗原的浓度成正比。

抗原定量检测

血清学反应


单克隆抗体技术


多克隆抗体

由于抗原分子具有多种抗原决定簇，每一种决定簇可激活具有相应抗原受体的 B 细胞产生免疫应答，因而可产生多种针对不同抗原决定簇的抗体，这些由不同 B 细胞克隆产生的抗体称之为多克隆抗体。

传统的方法制备的抗体是用抗原免疫动物后所得。



单克隆抗体技术单克隆抗体：抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的 B 细胞。被激活的 B 细胞分裂增殖形成效应 B 细胞（浆细胞）和记忆 B 细胞，大量的浆细胞克隆合成和分泌大量的抗体分子分布到血液、体液中。如果能选出一个制造一种专一抗体的浆细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞将合成针对一种抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体。


单一的 B 细胞克隆具有相同的性状

B 细胞能分泌特异性抗体，不能长期培养

骨髓瘤细胞不能分泌抗体，能长期培养

二者的融合细胞形成杂交瘤细胞，既能分泌特异性抗体，又能连续传代培养

单克隆抗体技术杂交瘤技术


杂交瘤技术原理：聚乙二醇（ PEG ）：细胞融合剂，使免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合HAT 培养基的选择培养：反复的免疫学检测筛选克隆化增殖的杂交瘤细胞系单克隆抗体生成：接种杂交瘤细胞于小鼠腹腔，腹水中即可得到高效价的单克隆抗体



杂交瘤细胞培养的关键HAT 培养基：

H（ Hypoxanthine） :次黄嘌呤A（ Aminopterin）：氨基喋呤；叶酸拮抗物，阻断 DNA合成主要途径 T(Thymidine)：胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前体”，供细胞通过替代途径合成 DNA

HAT 选择作用：淋巴细胞：不能生长， 5~7 天死亡； DNA 合成的主要途径被 A阻断骨髓瘤细胞：不能生长， 5~7 天死亡； HGPRT （次黄嘌呤 -鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase ）缺乏， DNA 合成的替代途径受阻




杂交瘤细胞筛选：杂交瘤细胞在融合后 2 周左右即可筛选，即把分泌所需抗体的杂交瘤孔从众多的孔中选出来，通常也称为抗体检测。选用抗体检测方法的原则是快速、敏感、特异、可靠、花费小和节省人力。

常用的抗体检测方法：（ 1 ）免疫酶技（ 2 ）免疫荧光技术（ 3）间接血凝试验（ 4）放射免疫测定


阳性杂交瘤细胞的克隆化培养与冻存有限稀释法 (limiting dilution)

显微操作法 (micromanipulation)

FACS法（ fluorescence activated cell sorter）软琼脂平板法 (soft agar method)



主要内容




由于抗原分子具有多种抗原决定簇，每一种决定簇可激活具有相应抗原受体的 B 细胞产生免疫应答，因而可产生多种针对不同抗原决定簇的抗体，这些由不同 B 细胞克隆产生的抗体称之为多克隆抗体。

传统的方法制备的抗体是用抗原免疫动物后所得。

多克隆抗体的制备



免疫动物的选择

供免疫用的动物主要有哺乳粪和禽类．其中常用的有家兔、绵羊、豚鼠和鸡，有时根据需要也可选用鼠，山羊和马等。选择动物时应考虑抗原与动物的种属关系、抗原性质与动物种类、免疫血清的需要量、免疫血清的要求以及动物个体的选择等因素。如甾体激素多用家兔；对于难以获得的抗原，且抗体需要量少，可用纯系小鼠制备。



佐剂（ adjuvant ）一类非特异性免疫增强剂，先于抗原或与抗原一起注入机体，可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型。佐剂种类 a. 油性乳剂 — 弗氏佐剂（ Freund adjuvant ）b. 无机化合物c. 微生物及其产物d. 脂质体e. 免疫刺激复合物（ ISCOM ）f. 细胞因子


用于人体的佐剂：氢氧化铝、明矾、 poly I∶C、胞壁酰二肽、细胞因子、热休克蛋白常用于动物实验的佐剂：弗氏佐剂 (Freund’s adjuvant) 弗氏佐剂 (Freund,s adjuvant) ：弗氏完全佐剂－羊毛脂与液体石蜡的混合物弗氏不完全佐剂－弗氏完全佐剂加卡介苗


试剂 : 抗原： OVA （卵清蛋白）抗体：一级抗体：小鼠血清二级抗体： HRP-Ab 封闭液： 5% 脱脂奶粉包被缓冲液抗体稀释液： PBS　洗液： PBST 底物溶液： OPD 终止液： 2M 硫酸弗氏完全佐剂弗氏不完全佐剂

器材 : 96孔板加样器 ( 一套）加样器头（一套）吸水纸（若干）酶标仪（一台） 1.5mlEP管： 20个 / 组 4mlEP管： 2个 / 组

实验器材及物品


主要操作步骤

一、免疫小鼠

二、制备血清

三、用 Elisa 法检测血清中抗体的效价


免疫方式肌肉注射（ intramuscular injection ， i.m. ）腹腔注射（ intraperitoneal injection ， i.p. ）皮下注射（ subcutaneous injection ， s.c. ）静脉注射（ intravenous injection ， i.v. ）

抗原： OVA 7 天免疫一次，共三次

免疫佐剂弗氏佐剂 (Immunoadjuvant ) 不完全弗氏佐剂（石蜡油 +羊毛脂）

免疫小鼠


摘取小鼠眼球，用 1.5ml EP 管接血。拉颈处死小鼠。 4000rpm ，离心 10 分钟，吸取上清（血清）待用。

制备血清


酶联免疫吸附（ enzyme-linked immunosorbent assay ， Elisa ）

利用抗原抗体反应的高度特异性和酶对底物高效催化性，将抗原或抗体吸附于固相载体表面，通过底物的显色反应鉴定抗原抗体结合的反应

ELISA 是目前应用最广泛的免疫学检测技术之一，常用来测量机体的可溶性的抗原或抗体。

由于它敏感性高，可测微量的的抗体或激素、细胞因子及粘附分子等抗原性物质。

免疫小鼠血清抗体效价测定


酶联免疫吸附的基本原理

利用连接于固相载体上的抗体和酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子上两个抗原决定簇结合，形成固相抗体 -抗原 -酶标抗体免疫复合物。复合物的形成量与待测抗原的含量成正比。测定复合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物质量 (OD值 ) ，即可确定待测抗原含量。



酶结合物　　

酶结合物是酶与抗体或抗原联结的产物。具有酶促反应，显示出生物放大作用。在 ELISA 中，常用的酶为辣根过氧化物酶 (horseradish peroxidase, HRP) 和碱性磷酸酶(alkaline phosohatase, AP) 。


酶的底物

1 、 HRP催化过氧化物的氧化反应。供氢体：邻苯二胺 (OPD) 、四甲基联苯胺 (TMB) OPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，最适

吸收波长为 492nm TMB 经 HRP作用后共产物显蓝色，用 HCL或 H2SO4终止后，由蓝色呈黄色，最适吸收波长为 405nm

2 、 AP为磷酸酯酶一般采用对硝基苯磷酸酯 (p-NPP) 作为底物。产物为黄色的对硝基酚，在 405nm波长处有吸收峰。用 NaOH终止酶反应


包被 : OVA 抗原 (50ug/ml) 100µL/孔 , 4 ℃过夜 .

封闭：弃上清 , 加入封闭液 150 µL/孔 , 37℃， 40min.

洗涤 : 弃上清，加洗液 200ul/孔，洗涤三次 , 每次 3分钟 .

一抗 : 弃上清 , 加入不同稀释度的待测血清抗体 100 µL/孔　 37℃ ，40min.

洗涤 :弃上清，加洗液 200ul/孔， 3分钟 ,弃上清，再重复两次

酶标抗体 :弃上清 , 加入 HRP标二抗 100 µL/孔 37℃ 40min.

洗涤 :弃上清，洗涤三次 , 每次 3分钟

显色 :弃上清，加入底物 100 µL/孔，避光 10min

加终止液 : 加 2M硫酸 50 µL/孔

测量 : 酶标仪测定 OD 490nm值 .

实验步骤


抗体的倍比稀释

1/200 1/400 1/800 1/1600 1/3200 1/6400 1/12800

5µL抗体 ( 血

清 )500µL

抗体稀释液(PBS)

500µL 500µL 500µL 500µL 500µL 500µL

1 2 3 4 5 6 7

995µL 抗体稀释液（ PBS）

加佐剂组（ +）和不加佐剂组（—）血清各做一套上述稀释度

加佐剂组（ +）和不加佐剂组（—）血清各做一套上述稀释度


每组一块 96孔板，每个样三个复孔，纵向排列。加样如下：1- 7: 不同稀释度的抗体，依次为 1/200， 1/400， 1/800， 1/1600，1/3200， 1/6400，　 1/12800； 8：阴性对照孔。

加板方法 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 　 11 12

A

B

C

D

E

F

G

H

加佐剂组

加佐剂组

不加佐剂组

不加佐剂组


抗体效价 :

1. 出现颜色变化的抗体最高稀释倍数

（目测）

2. 二倍于阴性对照 OD值 ( 酶标仪）

结果判定


结果分析

1 观察实验现象：从加底物到终止反映是的颜色

变化，及各个稀释度之间的颜色差异。

2 判定出加佐剂组和不加佐剂组的抗体效价（二倍于阴性对照 OD值）。

3 用 Excel处理数据，作图，横坐标为抗体的稀释度，纵坐标为 OD49

0的数值。

4 将用 Excel图表和原始数据（每人一份）贴到实验记录本上。


Excel 作图El i sa测定抗体效价

00. 20. 40. 60. 8

11. 21. 41. 61. 8

220

0

400

800

1600

3200

6400

1280

0抗体稀释倍数

OD49

0

加佐剂组不加佐剂组


主要内容




实验原理实验分组及材料主要操作步骤检测方法

实验主要内容


淋巴细胞在体外培养时，受到刺激物的刺激后可表现为细胞体积增大、

代谢旺盛、蛋白质和核酸合成增加，即向淋巴母细胞转化和增殖。此现

象称为淋巴细胞转化现象（简称为淋转）。

淋巴细胞转化率的高低可以反映机体的免疫水平，因此可作为测定机体

免疫功能的指标之一。

原理

Lymphocytes(B/T)

mitogens

Specificity Ag

Proliferationtransformation

lymphoblast

Nucleic Acid↑Protein ↑


人和小鼠人和小鼠TT细胞和细胞和BB细胞有丝裂原的比较细胞有丝裂原的比较

刀豆蛋白刀豆蛋白 AA（（Con Con AA））＋＋－－＋＋－－植物血凝素（植物血凝素（PHAPHA））＋＋－－＋＋－－美洲商陆（美洲商陆（PWMPWM））＋＋＋＋＋＋＋＋脂多糖（脂多糖（LPSLPS））－－＋＋－－＋＋葡萄球菌葡萄球菌AA蛋白（蛋白（SPASPA））－－＋＋－－－－

人人小鼠小鼠

TT细胞细胞 BB细胞细胞 TT细胞细胞 BB细胞细胞

人和小鼠人和小鼠TT细胞和细胞和BB细胞有丝裂原的比较细胞有丝裂原的比较

刀豆蛋白刀豆蛋白 AA（（Con Con AA））＋＋－－＋＋－－植物血凝素（植物血凝素（PHAPHA））＋＋－－＋＋－－美洲商陆（美洲商陆（PWMPWM））＋＋＋＋＋＋＋＋脂多糖（脂多糖（LPSLPS））－－＋＋－－＋＋葡萄球菌葡萄球菌AA蛋白（蛋白（SPASPA））－－＋＋－－－－

人人小鼠小鼠

TT细胞细胞 BB细胞细胞 TT细胞细胞 BB细胞细胞

有丝分裂原（mitogen ）来自植物蛋白或细菌产物，它能与多种细胞膜糖类及寡糖基分子结合，后者为丝分裂原受体、结合后能促使细胞活化和诱导细胞分裂。

T 和 B 细胞表面都有分裂素受体，在体外可非特异性刺激静止淋巴细胞向母细胞转化。这种转化细胞 DNA 合成增加，出现细胞体积增大，胞浆增多，嗜碱性以及产生有丝分裂等形态变化。


形态学观察法

3H-TdR（ 3H-胸腺嘧啶核苷）掺入法

MTT 法 ( 四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法）

本次实验采用 MTT 法

常用的检测方法


MTT 法即四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法。 MTT 是一种噻唑盐，化学名 3-（ 4， 5-二甲基 -2-噻唑） -2 ， 5-二苯基溴化四唑，水溶液为黄橙色。小鼠脾细胞受到ConA 作用后发生增殖活化，其胞内线粒体琥珀酸脱氢酶活性相应升高， MTT 作为其底物参与反应，形成蓝色的甲簪（ Formazan ）颗粒沉积于细胞内或细胞周围，用二甲亚砜 (DMSO) 溶解所生成的甲簪颗粒，其生成量与细胞数目和 / 或细胞活性呈正相关，通过检测 490nm处光密度值变化，可间接反映细胞生长及增殖活性。

MTT 法


活活 // 增殖增殖期的细胞期的细胞

线粒体线粒体能量代谢能量代谢琥珀酸脱氢酶琥珀酸脱氢酶

MTTMTT

MTTMTT掺入掺入还还原原

甲簪颗粒甲簪颗粒formazanformazan

细胞内细胞内 // 周围周围溶解溶解测测 ODOD490490 值值

MTT 法

DMSODMSO

淋巴细胞转化率 =淋巴细胞转化率 =对照孔值对照孔值ConA 刺激孔值 - 对照孔孔值ConA 刺激孔值 - 对照孔孔值

×100%×100%


器材1. 75%酒精若干2. 无菌纱网 1 块 / 组3. 无菌平皿 1 块 / 组4. 无菌 96 孔培养板 1 块 / 组5. 细胞计数板 1套 / 组6. 显微镜 1台 / 组7. 可调微量加样器 1套 /4人8. 无菌吸头（大、中、小） 1套 /4人

9. EP管 25/4人10. 眼科剪、小镊子 1饭盒 /4人11. 细胞培养箱（ 37℃ 5%CO2)12. 酶标仪 1台13. 离心机 2个 /room14. 超净台 2个 /room15. 4mlEP管： 1个 / 组

动物及试剂

1. 小鼠 1只 / 组2. 培养液（ 1640) 无FCS 5ml/ 组3. 培养液（ 1640)10%FCS 10ml/ 组4. 1个空离心筒5. ConA （ 200ug/ml) 1ml/room4. MTT （ 5mg/ml) 　　　 0.7ml/

组　 5. 滤纸一块6. 二甲亚砜（ DMSO) 3ml/ 组


第一天杀鼠取脾捣碎获得细胞计数细胞稀释（1× 107）上样（100ul/孔） ConA 的梯度稀释上样（100ul /孔）将96孔板置于细胞培养箱，做好标记，5%CO2 37℃培养48小时

第三天取出96孔板加入MTT (5mg/ml) 10ul/孔 5% CO2 37℃，继续培养2小时。 2000rpm，离心10min。小心弃去上清，加入100ul/ 孔DMSO振荡，使颗粒全部溶解。

酶标仪测吸光度值：OD490nm结果判定：SI=ConA孔OD值/对照孔OD值

实验步骤


1W

无菌取脾研磨成单细胞悬液+1640

（无FBS)

无菌取脾研磨成单细胞悬液+1640

（无FBS)

细胞计数【?/ml】

取20ul细胞+980ul的1640

混匀后取出20ul细胞+20ul台盼蓝

细胞计数【?/ml】

取20ul细胞+980ul的1640


加板(三复孔)

(加法见附图)

加板(三复孔)

(加法见附图)调细胞浓度1×107个 /ml

调细胞浓度1×107个 /ml

5%CO2 37℃培养48小时


培养终止前2小时加入MTT

(5mg/ml) 20ul/孔

培养终止前2小时加入MTT

(5mg/ml) 20ul/孔

5% CO2 37℃

继续培养2小时

5% CO2 37℃

继续培养2小时

2000rpm 10min2000rpm 10min小心甩去上清，加入100ul/ 孔DMSO振荡，使颗粒全部溶解

小心甩去上清，加入100ul/ 孔DMSO振荡，使颗粒全部溶解

酶标仪测吸光度值：OD490nm


结果判定：SI=ConA孔OD值/对照孔OD值结果判定：SI=ConA孔OD值/对照孔OD值

操作流程


单细胞悬液的制备1. 小鼠脱臼处死，用酒精棉球擦试皮毛消毒。2. 于超净台内取出脾组织，放入预先盛有 2ml无血清 1640培养液的平皿内。3. 用纱网包裹住脾组织，用直头镊子固定组织，用弯头镊子轻压组织，将其捣碎。然后用 1000ul加样器将脾细胞悬液吸出，放入 50ml离心管，用 2ml 1640培养液冲洗，将细胞悬液吸出，也放入同一 50ml离心管中。

4. 2000rpm，常温离心 6分钟，弃上清，加 3ml含血清 1640培养液重悬细胞。

细胞计数1. 取上述制备好的细胞悬液混匀后取出 20ul ，加到盛有 980ul 1640培养基

的 EP管中，混匀后取出 20ul到一个新的 EP管中，再向其中加入 20ul台盼蓝染料，混匀后取 20ul计入到细胞计数版上，在显微镜下计数，计数方法见后。

2. 用含血清 1640培养液调细胞浓度至 1×107/ml ，每组所需总量为 3ml 。3. 注意 :在稀释前一定将原细胞悬液混匀，否则细胞长时间沉淀使细胞数不准

单细胞悬液的制备1. 小鼠脱臼处死，用酒精棉球擦试皮毛消毒。2. 于超净台内取出脾组织，放入预先盛有 2ml无血清 1640培养液的平皿内。3. 用纱网包裹住脾组织，用直头镊子固定组织，用弯头镊子轻压组织，将其捣碎。然后用 1000ul加样器将脾细胞悬液吸出，放入 50ml离心管，用 2ml 1640培养液冲洗，将细胞悬液吸出，也放入同一 50ml离心管中。

4. 2000rpm，常温离心 6分钟，弃上清，加 3ml含血清 1640培养液重悬细胞。

细胞计数1. 取上述制备好的细胞悬液混匀后取出 20ul ，加到盛有 980ul 1640培养基

的 EP管中，混匀后取出 20ul到一个新的 EP管中，再向其中加入 20ul台盼蓝染料，混匀后取 20ul计入到细胞计数版上，在显微镜下计数，计数方法见后。

2. 用含血清 1640培养液调细胞浓度至 1×107/ml ，每组所需总量为 3ml 。3. 注意 :在稀释前一定将原细胞悬液混匀，否则细胞长时间沉淀使细胞数不准

详细实验步骤


细胞计数板细胞计数板

4

查出四个 16个大方格的总细胞数 (X)；

算出每个大方格的细胞数： A=X/4

每个大方格的体积为： V=1mm×1mm×0.1mm=0.1mm3=10-4ml

制备的细胞悬液的细胞浓度（ /ml)=A ×104×稀释倍数 (100)

细胞计数


细胞培养1. 按图所示加板。2. 将板做好标记，在倒置显微镜下观察细胞，然后放于 37℃ 5%CO2培养箱中，培养48小时。

MTT掺入：1. 在终止培养前 2小时，在显微镜下观察细胞转化情况。2. 每孔内加入MTT （ 5mg/ml) 20ul ，加完后轻轻搕板，使MTT 和细胞混匀。3. 在 37℃ 5%CO2培养箱中继续培养 2小时，取出板，观察颜色变化，然后离心 2000rpm， 10min ，轻轻甩去上清，注意不要将孔底部的颗粒物弃出）观察板底是否有蓝色的颗粒。

4. 加入 100ul 二甲亚砜（ DMSO) ，轻轻晃板，将颗粒溶解。结果测定：

1. 结果测量：用酶标仪测定 490nm处光密度值（ OD490nm），记录结果。

2. 结果判定：

详细实验步骤

淋巴细胞转化率 =淋巴细胞转化率 =对照孔值对照孔值ConA 刺激孔值 - 对照孔孔值ConA 刺激孔值 - 对照孔孔值

×100%×100%


100µL ConA 200ug/ml

ConA 的倍比稀释

400µL 含 10% 血清的 1640

400µL 400µL 400µL 400µL 400µL 400µL

1 2 3 4 5 6 7 900

µL含血清的 1640

900µL含血清的 1640

20 10 5 2.5 1.25 0.625 0.313 ug/ml

0 0

400µL 含 10% 血清的 1640


1

2

3

5

4

7

6

0

1 1 1

每个样品设置三复孔100ul spleen Cell+

100ul ConA 20ug/ml

100ul spleen cell +

100ul ConA 10ug/ml

100ul spleen Cell+

100ul ConA 5ug/ml

100ul spleen Cell+

100ul ConA 2.5ug/ml

100ul spleen Cell+

100ul ConA 1.25ug/ml

100ul spleen Cell+


100ul spleen Cell+


100ul spleen Cell+

100ul 10% 1640

100ul spleen Cell+

100ul ConA 20ug/ml

100ul spleen cell +

100ul ConA 10ug/ml

100ul spleen Cell+

100ul ConA 5ug/ml

100ul spleen Cell+

100ul ConA 2.5ug/ml

100ul spleen Cell+


100ul spleen Cell+


100ul spleen Cell+


100ul spleen Cell+

100ul 10% 1640 “0”为培养基对照孔，颜色应逐渐变浅

2 2 2

3 3 34 4 45 5 56 6 67 7 70 0 0

加板方法


结果处理

算出 SI值，用 Excel 作图，横坐标为 ConA 的浓度，纵坐标为 SI值，要求带标准误差线。

把用酶标仪读出的原始数据（每人一份）和用 Excel 作的图一起贴到实验记录本上。

要对结果进行分析，写出影响结果的因素，及注意事项。


Excel 作图

淋巴细胞转化率

淋巴细胞转化率


主要内容




NK （ natural killer ）细胞属非特异性免疫细胞，为机体的天然免疫系统中主要的效应细胞，是与 T 、 B 细胞并列的第三类群淋巴细胞。

NK 细胞从骨髓中衍生，发育成熟需要骨髓和胸腺微环境

NK 细胞主要分布于外周血中，占外周血单核细胞（ PBMC）的 5-10%，在淋巴器官中也有分布，分布水平较外周血低。


NK 细胞功能：清除异常细胞

通过杀伤激活受体（ KAR ）直接识别

通过抗体间接识别： ADCC

分泌杀伤介质： perforin granzyme TNF IFN

清除异常细胞清除异常细胞（肿瘤、病原体感染）（肿瘤、病原体感染）


通过杀伤激活受体（ KAR）直接识别


通过抗体间接识别： ADCC


实验原理

NK 细胞 +靶细胞

靶细胞破裂 ,释放内容物

胞浆内酶类

LDH酶活性

胞浆内蛋白放射性铬酸钠51Cr标记

DNA3H-TdR掺入


乳酸脱氢酶 (LDH) 存在于细胞内，正常情况下，不能透过细胞膜。当细胞受到损伤时， LDH可从细胞内释放至培养液中。释放出来的 LDH在催化乳酸生成丙酮酸的过程中，使氧化型辅酶 I(NAD+)变成还原型辅酶 (NADH) ，后者再通过递氢体 -吩嗪二甲酯硫酸盐 (PMS)还原碘硝基氯化氮唑蓝 (INT) 或硝基氯化四氮唑蓝 (NBT) 形成有色的甲基化合物，在 570nm波长处有一吸收峰，利用读取的Ａ值，可测得杀伤细胞毒活性。

乳酸脱氢酶释放法 -原理


靶细胞靶细胞YAC-1YAC-1

NKNK杀伤杀伤

LDHLDH释放到细胞外释放到细胞外

无色底物无色底物 (INT) 或 (NBT)LDHLDH底物底物

还还原原

有色物质有色物质测测 ODOD570570

值值

乳酸脱氢酶释放法

靶细胞靶细胞膜损伤膜损伤

最大释放均值（ Max） =最大释放孔 cpm均值 -最大释放对照孔 cpm均值

自发释放均值（ S 自发） =自发释放孔 cpm均值 - 培养基对照孔 cpm均值

最大释放均值（ Max） =最大释放孔 cpm均值 -最大释放对照孔 cpm均值

自发释放均值（ S 自发） =自发释放孔 cpm均值 - 培养基对照孔 cpm均值

杀伤率 ( %)= 杀伤率 ( %)=Max- S 自发

Max- S 自发

实验值 -自发释放值实验值 -自发释放值 ×100×100


器材1. 75%酒精若干2. 无菌纱网 1 块 / 组3. 无菌平皿 1 块 / 组4. 无菌吸头（大、中、小） 3盒 /room

5. 无菌 96孔培养板 1 块 / 组6. 可调微量加样器 1套 / 组7. 细胞计数板 1套 / 组8. 显微镜 1台 / 组9. EP 管若干10. 眼科剪、小镊子 1套 / 组11. 细胞培养箱 1台 /room

12. 酶标仪 1台13. 离心机 2个 /room

14. 超净台 1台 / 组15. 4mlEP 管： 2个 / 组

动物、细胞及试剂1. 小鼠 1只

/ 组 (NS,OVA)

2. YAC-1 1*105 * 2ml

3. 培养液（ 1640) 无 FCS

5ml/ 组3. 培养液 (1640) 3%FCS

10ml/ 组3. LDH底物 3ml/ 组4. 柠檬酸（终止液） 1ml/ 组

分组：每组分组：每组 44人人 11只小鼠只小鼠实验分组及材料


1W

无菌取脾研磨成单细胞悬液+2ml 1640

（无FBS)


（无FBS)

细胞计数【?/ml】取20ul细胞+980ul的1640




加板(三复孔)

(加法见附图)

加板(三复孔)

(加法见附图)调细胞浓度1×107 /ml

调细胞浓度1×107 /ml



离心，取100ul上清移入新孔， 37℃孵育10min


加入底物 100ul/well

室温避光孵育15min



30l /孔 1mol/L柠檬酸30l /孔 1mol/L柠檬酸



结果判定：结果判定：

培养YAC－1细胞＋10%FBS 1640培养液


调细胞浓度1×105/ml


1W


（无FBS)


（无FBS)





加板(三复孔)

(加法见附图)

加板(三复孔)

(加法见附图)调细胞浓度1×107 /ml

调细胞浓度1×107 /ml









30l /孔 1mol/L柠檬酸30l /孔 1mol/L柠檬酸



结果判定：结果判定：





操作流程


单细胞悬液的制备1. 小鼠脱臼处死，用酒精棉球擦试皮毛消毒。2. 于超净台内取出脾组织，放入预先盛有 2ml 1640培养液的平皿内。3. 用纱网将脾组织包裹住，用直头镊子固定组织，用弯头镊子轻压组织，将其捣碎。然后用 1000ul加样器将细胞悬液吸出，放入50ml 离心管中，用 2ml 1640培养液冲洗，将细胞悬液吸出，也放入同一 50ml离心管中。

4. 1000rpm，常温离心 6分钟，弃上清，加3ml 1640培养液重悬细胞。细胞计数：

1. 取上述制备好的细胞悬液混匀后取出 20ul ，加到盛有 980ul 1640培养基的EP管中，混匀后取出 20ul到一个新的 EP管中，再向其中加入 20ul台盼蓝染料，混匀后取 20ul计入到细胞计数版上，在显微镜下计数，计数方法见后。

2. 调脾细胞浓度至 1×107/ml ，每组所需总量为 1ml3. 调 YAC－ 1 细胞浓度至 1×105/ml ，每组需 2ml

单细胞悬液的制备1. 小鼠脱臼处死，用酒精棉球擦试皮毛消毒。2. 于超净台内取出脾组织，放入预先盛有 2ml 1640培养液的平皿内。3. 用纱网将脾组织包裹住，用直头镊子固定组织，用弯头镊子轻压组织，将其捣碎。然后用 1000ul加样器将细胞悬液吸出，放入50ml 离心管中，用 2ml 1640培养液冲洗，将细胞悬液吸出，也放入同一 50ml离心管中。

4. 1000rpm，常温离心 6分钟，弃上清，加3ml 1640培养液重悬细胞。细胞计数：

1. 取上述制备好的细胞悬液混匀后取出 20ul ，加到盛有 980ul 1640培养基的EP管中，混匀后取出 20ul到一个新的 EP管中，再向其中加入 20ul台盼蓝染料，混匀后取 20ul计入到细胞计数版上，在显微镜下计数，计数方法见后。

2. 调脾细胞浓度至 1×107/ml ，每组所需总量为 1ml3. 调 YAC－ 1 细胞浓度至 1×105/ml ，每组需 2ml

实验步骤


细胞培养：1. 按图所示加板。2. 将板做好标记，在倒置显微镜下观察细胞，然后放于 37℃ 5%CO2培养箱中，培养 2小时。

LDH底物：1. 在培养 2小后， 1000rpm，离心 5min ，取 100ul上清液移入新孔内，于每孔内加入 LDH底物 100ul ，加完后轻轻搕板，使之混匀。

2. 室温避光保存 15min 。 3. 取出，加入 1mol/L 柠檬酸，终止反应， 30l /孔。酶标仪读数前保证没有气泡。

结果测定：1. 结果测量：用酶标仪测定光密度值： OD570nm。记录结果。

2. 结果判定：

细胞培养：1. 按图所示加板。2. 将板做好标记，在倒置显微镜下观察细胞，然后放于 37℃ 5%CO2培养箱中，培养 2小时。

LDH底物：1. 在培养 2小后， 1000rpm，离心 5min ，取 100ul上清液移入新孔内，于每孔内加入 LDH底物 100ul ，加完后轻轻搕板，使之混匀。

2. 室温避光保存 15min 。 3. 取出，加入 1mol/L 柠檬酸，终止反应， 30l /孔。酶标仪读数前保证没有气泡。

结果测定：1. 结果测量：用酶标仪测定光密度值： OD570nm。记录结果。

2. 结果判定：


1-3 4-6 7-9 10-12

A自然释放孔

100ul YAC-1 cells+

100ul 10% 1640

B(E:T=100:1 ）

100ul YAC-1 cells+ 100ul spleen Cells

C(E:T=50:1 ）

100ul YAC-1 cells+ 50ul spleen Cells +

50ul 10%1640

D(E:T=25:1 ）

100ul YAC-1 cells+ 25ul spleen Cells +

75ul 10%1640

E最大释放孔

100ul YAC-1 cells+

100ul 1% NP-40

F最大释放对照孔

100ul 1% NP-40 + 100ul 10% 1640

G培养基对照孔

200ul 10% 1640

Max=E-F

S 自发 =A-G

Max=E-F

S 自发 =A-GMax- S 自发Max- S 自发

B,C,D A 实验孔值 -自然释放孔值

B,C,D A 实验孔值 -自然释放孔值

×100%×100%SI=SI=

加

板

方

法

加

板

方

法


算出不同E:T 时的 SI值，用 Excel 作图，横坐标为 E:T,纵坐标为 SI值。

把用酶标仪读出的原始数据（每人一份）和用 Excel 作的图一起贴到实验记录本上。

要对结果进行分析，写出影响结果的因素，及注意事项。

结果处理


NK杀伤实验

0

10

20

30

40

50

100: 1 50: 1 25: 1

E T：

SI Excel 作图

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免疫实验理论讲授