METODOLOGIA:Preparar el medio de cultivo YP (extracto de 10 g / L de levadura, 10 g / L de peptona, 20 g / L de agar) en el cual se realizara la resiembra de la levadura. tambin se complementaron con 6 g / L de cido tartrico, 30 mg / ml de eritromicina o 30 mg / ml de cloranfenicol para el aislamiento de la cepa.El docente proporcionara una caja petri con crecimiento de la levadura (Saccharomyces cerevisiae). Se ocuparla tcnica de aislamiento por extensin con varilla porque es la ms recomendada para bacterias, mohos y levaduras. Colocamos el inoculo sobre el medio del cultivo, posteriormente se toma una varilla de vidrio o de acero inoxidable de que tenga la longitud de dimetro de la placa de Petri. Esta varilla se introduce en un frasco con alcohol y se flamea a la flama del mechero por lo menos tres veces para esterilizar, se deja enfriar y se esparce el inoculo sobre la superficie del agar. Se deja en posicin vertical derecha y se incuba.Una vez realizado el aislamiento se incubaran a una temperatura con un rango de 22-29 C, trascurrido 48 horas se verificara si hay crecimiento. Ya gelificado el agar se realizara el aislamiento del microorganismo (tcnica de aislamiento por extensin de varilla).Se esterilizara el medio de cultivo (si es necesario las cajas petri) en la autoclave, terminado la esterilizacin dejar que su temperatura disminuya y verterlas en las cajas petri.

Se realizara la cuantificacin de levaduras totales

Colocar un cubre objetos tapando parcialmente la caja de Neubauer y con la pipeta automtica cogemos una muestra de la suspensin y la colocamos cuidadosamente en la caja. Donde por efecto de capilaridad el fondo de la cmara se llena antes de que la solucin pueda desbordarse. Llevamos la cmara a observacin en el microscopio, donde primeramente ubicamos la caja con el lente de aumento 5x. luego con el de 10x observamos el cuadro central, y con el lente de 40x procedemos hacer el conteo de las colonias .

Conteo con la cmara de Neubauer.

Preparacin de la solucin de sacarosa 100g/ L:Coloca en cero o en tara la bscula, Pesar 100 g de glucosa Cuidadosamente transfiere la glucosa pesada a un recipiente limpio en un vaso de pp. Mide 1 L de agua en un vaso y Agrega el agua al recipiente con el azcar

Esterilizar el material el matraz donde se realiza la inoculacin por 15minutos a 10 PSIA.

-TECNICAS ANALITICASColocar papel filtro a peso constante en la estufa durante 24hs y pesarRealizar cuantificacin de azucares (sf) con el lquido de la filtracinPESO SECO ( Xf)Colocar en la estufa el slido de la filtracin en la estufa a 70c durante 24 h.Inoculacin; se aaden 25 ml de la solucin de sacarosa en un matraz, con las levaduras totales Dejar reposar durante30 a 72 horas en temperatura ambiente Producto de la fermentacin; Una vez pasadas las 72 horas tomamos una muestra y filtramos Construccin del reactorEn un frasco con tapa rosca realizamos tres perforaciones en la tapa del frasco insertamos tres varillas de vidrio (que estas no toquen el fondo del frasco) poner en cada una de las varillas .En la manguera de en medio estar conectada una bomba de aire

Poner la solucin de sacarosa junto con el inoculo dentro del reactor y esterilizar PREPARACION DE DNS:Se pesan 5g de cido 3,5 dinitrosalicilico 150g de tartrato de NaK y 8 g de NaOHSe disuelve el NaOH en 200ml de aguaSe aade en agitacin el tartrato de NaK lentamenteSe completa con agua destilada hasta 400ml y se comienza a aadir lentamente el cido 3,5 dinitrosalicilicoSe deja en agitacin y se deposita en un frasco, se deja un da en reposo y en la obscuridad

Cuantificacin de azucares reductores por DNS:en un tubo de cristal de 10ml se adiciona 0.5ml de muestra y 0.5ml de reactivo de DNSLos tubos se colocan en bao mara a 100 C por 5minSe enfra hasta temperatura ambiente Se aade5 ml de agua destilada se agitaSe realiza lectura en el espectrofotmetro a 540nm

PRUEBA DE YODOFORMOEste consiste en agregar a 5 ml del medio de cultivo con crecimiento de levaduras durante 48 hora, 2 ml de hidrxido de sodio y 3 ml de lugol lentamente, esta mezcla se dejara reposar 5 minutos y si hay presencia de etanol se observa un precipitado amarillo correspondiente a la formacin de yodoformo.

DETERMINACION SEMI-CUANTITATIVA DE ETANOL POR LA TECNICA DEL DICROMATO DE POTASIO.La tcnica de dicromato consiste en tomar 2 ml de medio crecido de levaduras(centrifugarlo a 3200 rpm durante 30 minutos) y mezclarlo con 2ml de una solucin oxidante de dicromato de potasio. La mezcla se homogenizo en vrtex a 1500rpm y se calent en bao termostatado de 80-85 C, Por 30 min. Se enfrio a temperatura ambiente y se ley la absorbancia a 440nm y se enterpolo en la curva de calibracin , reportando el valor de etanol en g/l en dos tiempos 24 y 48 horasDETERMINACION SEMI-CUANTITATIVA DE ETANOL POR LA TECNICA DEL DICROMATO DE POTASIO.La tcnica de dicromato consiste en tomar 2 ml de medio crecido de levaduras(centrifugarlo a 3200 rpm durante 30 minutos) y mezclarlo con 2ml de una solucin oxidante de dicromato de potasio. La mezcla se homogenizo en vrtex a 1500rpm y se calent en bao termostatado de 80-85 C, Por 30 min. Se enfrio a temperatura ambiente y se ley la absorbancia a 440nm y se enterpolo en la curva de calibracin , reportando el valor de etanol en g/l en dos tiempos 24 y 48 horas

DETERMINACION SEMI-CUANTITATIVA DE ETANOL POR LA TECNICA DEL DICROMATO DE POTASIO.La tcnica de dicromato consiste en tomar 2 ml de medio crecido de levaduras(centrifugarlo a 3200 rpm durante 30 minutos) y mezclarlo con 2ml de una solucin oxidante de dicromato de potasio. La mezcla se homogenizo en vrtex a 1500rpm y se calent en bao termostatado de 80-85 C, Por 30 min. Se enfrio a temperatura ambiente y se ley la absorbancia a 440nm y se enterpolo en la curva de calibracin , reportando el valor de etanol en g/l en dos tiempos 24 y 48 horasDETERMINACION SEMI-CUANTITATIVA DE ETANOL POR LA TECNICA DEL DICROMATO DE POTASIO.La tcnica de dicromato consiste en tomar 2 ml de medio crecido de levaduras(centrifugarlo a 3200 rpm durante 30 minutos) y mezclarlo con 2ml de una solucin oxidante de dicromato de potasio. La mezcla se homogenizo en vrtex a 1500rpm y se calent en bao termostatado de 80-85 C, Por 30 min. Se enfrio a temperatura ambiente y se ley la absorbancia a 440nm y se enterpolo en la curva de calibracin , reportando el valor de etanol en g/l en dos tiempos 24 y 48 horas