E. Macromoléculas. Rev 27/11/2013

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TEMA 8. PLEGAMIENTO DE PROTEINAS

Según la capacidad de las proteínas de adoptar plegamientos tridimensionales

definidos podemos clasificar a las proteínas en tres grupos:

Proteínas con una estructura tridimensional claramente definida.

Proteínas que pueden oscilar entre un número finitio de conformaciones

alternativas.

Proteínas intrínsicamente desectructuradas (Intrisically disordered

proteins). Se habla de IDP tanto en caso de proteínas que no tienen

ninguna estructura, como las que tienen un core estructurado pero gran

parte de la secuencia sin estructura.

Figura 1. NCBD, un ejemplo de proteína que adopta diferentes formas plegadas.

Figura 2. Detalle de cambios conformacionales locales en quinasas ligados a la unión de

ligando. Es un caso común de modulación de folding por unión a ligandos.

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La estructura tridimensional de las proteínas (o su falta) está implícita en su

estructura primaria (su secuencia aminoácidica). Este hecho queda demostrado por el

gran número de proteínas que pueden desnaturalizarse y después renaturalizarse in vitro

sin la presencia de ningún cofactor o coayudante. Los recientes descubrimientos de la

existencia de numerosas proteínas que facilitan el plegamiento de las proteínas in vivo

(rotamasas, disulfide-isomerases, chaperones) no cambian nada el “dogma” central del

campo que es “que las proteínas contienen la información necesaria para replegarse”.

Las proteínas facilitadoras del plegamiento lo que hacen es simplemente catalizar, hacer

más rápido y eficiente el plegamiento, llevarlo hacia su final de manera más eficiente, al

i) mejorar la cinética de la ruta productiva del plegamiento y ii) evitar la formación de

estructuras no nativas.

Una interesante “excepción al dogma” lo representan las proteínas que pueden

adoptar dos o más estructuras. Estas proteínas “seleccionan” una de sus formas

accesibles en función del ligando (típicamente otra proteína) con la que interaccionan.

Con ello consiguen realizar varias funciones con una única secuencia (son lo que se

conocen como proteínas pluriemepleadas o “moolighting proteins”); si quereís ver una

discusión sobre estas proteínas ver por ejemplo (J.Am.Chem.Soc. (2011) 133, 12154-

12161)), o bien consiguen desencadenar respuestas complejas como consecuencia del

cambio conformacional ligado a la unión de un ligando.

Otra interesante “excepción al dogma” son las IDPs. Son proteínas, muy raras en

organismos inferiores, pero muy prevalente en organismos complejos que tienen la

totalidad o una parte importante de la secuencia sin estructura definida. Son proteínas

con secuencias muy repetitivas (de baja complejidad), pobres en aminoácidos apolares y

que precisan de otra macromolécula, típicamente otra proteína o un ácido nucleico para

plegarse. Pueden estar involucradas en “pluriempleo”, o en procesos complejos de

regulación (por ejemplo son comunes en proteínas de unión al DNA).

LA PARADOJA DE LEVINTHAL

El hecho de que muchas proteínas se plieguen solas de una manera tan

fidedigna, “independientemente” del medio celular y de un modo tan rápido es una

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paradoja aún no resuelta completamente, y formulada por primera vez por Levinthal.

Esta paradoja se formula de la siguiente manera: una cadena polipeptídica pequeña tiene

100 residuos, solo contando los ángulos y y contando que cada 30 grados se tiene

una conformación diferente tenemos para cada residuo 144 confórmeros y para la

proteína en su conjunto un total de 12200

confórmeros distintos. Si suponemos (y es una

suposición muy favorable) que cada 10 fs podemos cambiar de uno a otro confórmero

tendremos que para explorar todo el espacio conformacional la proteína necesitaría unos

10173

millones de años para plegarse. Un tiempo infinitamente superior a la edad del

universo. En realidad el tiempo de plegamiento de una proteína oscila entre el

microsegundo al minuto. Como toda paradoja ésta no tiene una solución obvia, y

durante muchos años ha existido un fuerte debate al respecto. A lo largo de este capítulo

veremos algunas ideas de cómo pensamos hoy que la proteína consigue resolverla.

La paradoja de Lenvinthal no pierde fuerza cuando pensamos en IDPs o en

proteínas con múltiples estructuras, ya que al final, sea sola, o en presencia de ligando la

proteína adopta una estructura tridimensional y lo hace de manera rápida y fidedigna.

Tampoco le resta fuerza la existéncia de maquinaria celular que acelera el plegamiento

de la proteína, porque la forma nativa continua siendo una propiedad intrínseca de la

proteína.

FUERZAS QUE CONDICIONAN EL PLEGAMIENTO DE LAS PROTEINAS

El plegamiento de una proteína debe conducir a un mínimo de energía libre, es

decir que la variación de energía libre a lo largo del plegamiento debe ser negativa:

Gfold) . Ignoramos si este mínimo es el más estable, o simplemente es uno muy estable

al que se llega de manera sencilla en el proceso de plegamiento.

La variación de energía libre en el proceso de plegamiento vendrá dada por el

balance de dos términos: el entálpico y el entrópico. El plegamiento debe por tanto

intentar optimizar la energía del sistema (i.e. debe mejorar las interacciones del sistema

proteína-solvente) y por otro lado debe hacer aumentar el desorden del universo.

Empezaremos describiendo las interacciones que marcan la estabilidad de las proteínas:

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Interacciones de enlace

La forma nativa de las proteínas presenta todas las distancias y casi todos los

ángulos próximos a los valores de equilibrio. La gran mayoría de las torsiones están

también en sus zonas estéricamente más favorecidas (e.j. mínimos mapa de

Ramachandran). Respecto a los enlaces amida en general se encuentran en la

conformación trans, con la excepción de las prolinas que a veces se encuentran en la

conformación cis. Es de destacar que el cambio de prolinas de conformación cis a trans

es muy importante in vivo y que incluso existen enzimas dedicado a catalizar este

proceso (las peptidyl-proline-isomerases o rotamases).

Unos enlaces covalentes que merecen especial atención son los puentes

disulfuro. Estos puentes se forman entre 2 cisteinas cuyas cadenas laterales se

encuentran próximas en el espacio. Los puentes disulfuros estabilizan en general la

estructura de la proteína como lo demuestra que las proteínas de vida extracelular

tengan una gran riqueza de los mismos. No obstante, en general los puentes disulfuro no

mejoran la cinética del plegamiento, ya que a lo largo del mismo se forman (y han de

romperse) puentes disulfuro no nativos y esto puede hacer muy lento el proceso de

plegamiento. De hecho, proteínas que se pliegan en microsegundos pueden tardar

minutos si existen posibilidades de formar puentes disulfuro no nativos en el

plegamiento. La naturaleza ha diseñado las Protein Disulfide Isomerases como un

mecanismo para facilitar la formación de los puentes disulfuro nativos y desestabilizar

los no nativos.

Interacciones no enlazantes

Son el conjunto de interacciones electrostáticas y de van der Waals que modulan

la interacción entre átomos no ligados por enlaces. Por tradición las interacciones no

enlazantes se clasifican en este campo en tres tipos en función de su teórica intensidad

en fase gas (medio anhidro).

Interacciones no específicas. Son un conjunto de interacciones de van der Waals

e interacciones electrostáticas débiles (en general interacciones de menos de 1 kcal/mol)

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que per se contribuyen poco a la estabilidad de la proteína, pero que en su conjunto son

muy importantes ya que son muy abundantes.

Los puentes de hidrógeno son interacciones básicamente electrostáticas de una

intensidad moderada (menos de 10 kcal/mol). Son muy direccionales y su existencia es

clave en todos los fenómenos de reconocimiento molecular y en los de formación de

estructura secundaria.

Las interacciones iónicas. También denominadas puentes salinos se forman entre

cadenas laterales de residuos cargados. Son totalmente interacciones electrostáticas,

tienen mucha importancia en el reconocimiento molecular a largas distancias y pueden

ser extraordinariamente intensas (superiores a 10 kcal/mol en fases apolares).

Durante muchos años se pensó que como en otros sistemas químicos, los

términos de enlace eran los que determinaban la estructura tridimensional de las

proteínas. Esto fue refutado por Alfinsen a principios de los sesenta (PNAS, 47, 1309

(1961)) cuando realizó un experimento clave que demostró que son las interacciones

no-enlazantes y no las enlazantes (puentes disulfuro) las que guían el plegamiento. Para

este experimento Anfinsen cogió ribonucleasa, una proteína pequeña (14000 Daltons) y

que tiene 4 puentes disulfuro. Desnaturalizó el enzima con urea y b-mercaptoetanol la

solución resultante la dividió en dos alícuotas P1 y P2. A la alícuotas P1 le eliminó

primero el -mercaptoetanol, dejo reposar y le eliminó luego la urea (alícuota resultante

P1bis). A la alícuotas P2 le eliminó primero la urea, y luego el -mercaptoetanol

(alícuota resultante P2b). Una vez hecho esto miro la actividad enzimática de P1bis y

P2bis. Encontró que la alícuota P2b había mucha actividad enzimática, mientras que en

P1b prácticamente no había nada. Esto demostraba que eran las interacciones no-

enlazantes y no las interacciones enlazantes las que guiaban el plegamiento de las

proteínas, pero no

determinaba cual de

ellas era la más

relevante.

urea

-Mercapto

-urea

-Mercapto

-Mercapto

-urea

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Figura 3. Esquema del experimento de Anfinsen. Rojo significa alícuota no activa, azul

activa

En un principio se pensó que eran los puentes salinos, dada su alta estabilidad

los responsables del plegamiento. Esta hipótesis está actualmente descartada por

diversos hechos: i) no todas las proteínas tienen puentes salinos, ii) el número de

puentes salinos que se forma en una proteína nativa es solo una porción de los que se

podrían formar, iii) los grupos cargados se encuentran mayoritariamente hacia el

exterior de la proteína, no hacia el interior que es donde prediciría la hipótesis de que

son claves. Además, cálculos teóricos han demostrado que la formación de puentes

salinos en agua está desfavorecida por el alto coste que supone desolvatar los iones que

forman el par. Recientemente, la mutagénesis dirigida ha demostrado que los puentes

salinos no son vitales para la estructura, ni aún en casos en los que están en el interior de

la proteína. En el experimento (Nature Structural Biology, 2, 122 (1995)) los autores

cogieron una proteína represor Arc que posee un puente salino interno doble (Arg31,

Glu36, Arg40) y mutaron los tres residuos por tres residuos apolares, en concreto por

Met, Tyr y Leu (respectivamente). La proteína resultante que ganaba contactos

hidropóbicos, pero que perdia el puente salino resultó ser mas de 4 kcal/mol más estable

que la proteína nativa!. En resumen, los puentes salinos pueden ser importantes para

mantener zonas concretas de proteínas, claves en el reconocimiento, y pueden ser

importantes en la guía del plegamiento, pero parece que no son los determinantes del

mismo.

Los puentes de hidrógeno son también candidatos razonables a tener un papel

clave en el plegamiento de las proteínas. Son abundantes, son claves en la estructura

secundaria, son relativamente intensos y muy direccionales. No obstante, parece

asumido que a pesar de su importancia, no son los puentes de hidrógeno los

determinantes del plegamiento, a pesar de su importancia. Esto es por dos razones

fundamentales: i) son interacciones demasiado direccionales y de corto alcance para

organizar el plegamiento global de la proteína, ii) si se cuentan los puentes de hidrógeno

totales de una proteína (proteína-proteína, y proteína-agua) se ve fácilmente que el

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número de puentes de hidrógeno totales no varia demasiado al producirse el

plegamiento de la proteína:

Así pues, no existe una fuerza única responsable del plegamiento de la proteína,

sino que dicho plegamiento depende de un conjunto de interacciones muchas de ellas de

escasa intensidad. Más importante aún para entender el plegamiento de una proteína es

pensar que la proteína es una cadena polipeptídica sumergida en agua, y que la

estructura de la misma cambia drásticamente a lo largo del proceso de plegamiento.

TERMODINAMICA DEL PLEGAMIENTO (ENTALPIA/ENTROPIA DE

PLEGAMIENTO)

El proceso de plegamiento de una proteína implica una variación del término

entálpico que se puede asociar a la variación de energía del sistema. La entalpía de

plegamiento dependerá pues del balance de la energía proteína-proteína, agua-proteína y

agua-agua. El término entrópico dependerá del grado de desorden que se consiga en el

proceso de plegamiento en la proteína y en el agua que la rodea.

Es sencillo ver que en el proceso de plegamiento se produce una mejora en las

interacciones proteína-proteína (p.ej se forman muchos puentes de hidrógeno entre los

residuos aminoacídicos) y que por el contrario el término entrópico es desfavorable ya

que la forma desnaturalizada “random-coil” está muy desordenada y la forma plegada

está muy ordenada. Si en principio tuviéramos 12200

estados (confórmeros) accesibles

en la forma desplegada, el costo entrópico de pasar a uno solo (forma plegada) sería

enorme (del orden de 200 kcal/mol). Esto no parece razonable, pero cual es entonces el

grado de desorden de la forma desplegada? Tradicionalmente se suponía que la forma

desplegada estaba muestreando una gran región del espacio configuracional accesible,

pero trabajos recientes de dinámica molecular y espectroscopía de NMR demuestran

que de hecho el estado desplegado es una combinación finita de un número limitado de

estados. La interconversión entre ellos es lo que da una imagen de desorden absoluto.

Esta nueva hipótesis sobre la entropía del estado desplegado tiene unas consecuencias

claras: al ser el número de estados accedidos por la forma desplegada más pequeño de

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lo que se esperaba, el coste entrópico del plegamiento de la cadena es también más

reducido, pero aun así es claro que la variación de entropía en la cadena es negativa y

que por lo tanto desfavorece mucho el proceso de plegamiento de la proteína.

Como se compensa el aumento de orden en la cadena polipeptídica?. Pues

gracias al aumento en el desorden el agua que rodea a la proteína. Esto nos lleva a

hablar del papel del agua en el plegamiento. El agua solvata tanto la forma plegada

como la desplegada de la proteína, por lo que es de esperar que juegue un papel

importante en el plegamiento. De hecho el agua modula el plegamiento de las proteínas

tanto a nivel entálpico, como a nivel entrópico. El agua forma puentes de hidrógeno con

ella misma y con todos los grupos polares de la proteína. En principio se formarán más

puentes de hidrógeno proteína-agua en la forma desnaturalizada, lo que podría inducir a

pensar que el agua desfavorece el plegamiento. No obstante, sabemos que el agua

favorece el plegamiento y de hecho remover agua con agentes hidrofóbicos es uno de

los mecanismos para desnaturalizar proteínas. Por que?

Cuando una cadena polipeptídica esta desordenada en agua sus grupos polares y

apolares se encuentran rodeados de moléculas de agua. El agua cuando está cercana a

los grupos apolares expuestos (lo que pasa en la forma desnaturalizada) no puede

interaccionar intensamente con ellas y reacciona formando estructuras poliédrica

altamente ordenadas alrededor del soluto. Estas estructuras tienen por objeto maximizar

la estabilidad intrínseca del agua entorno al soluto, pero tiene como inconveniente su

gran orden que hace que cuando estas estructuras se forman aumente el orden del agua.

Cuando 2 grupos hidrofóbicos se encuentran en solución cada uno de ellos forma uno

de estos poliedros de alta ordenación, con lo que la situación entrópica será peor. La

respuesta del sistema es la de comprimir los 2 grupos apolares (igual que 2 gotas de

aceite en agua) para que al juntarse el area accesible al solvente del conjunto se reduzca.

De esta manera los poliedros de alto orden se hacen más pequeños (que la suma de los 2

poliedros que existen antes de la fusión) liberándose en el proceso moléculas de agua

que aumentan el desorden del solvente. El efecto descrito se conoce como “efecto

hidrofóbico” y es el que hoy se asume que guía el plegamiento de la proteína hasta un

estado de colapso hidrofóbico (el molten globule), una forma compacta donde los

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residuos apolares ya están hacia el interior. La evolución de este estado compacto a la

forma nativa es entonces mucho más sencilla, ya que implica solo movimientos locales.

CINETICA DEL PLEGAMIENTO

La termodinámica del plegamiento es compleja de estudiar, pero aún lo es más

la cinética del mismo. La razón es clara: la escala temporal del proceso es mucho más

rápida que nuestra capacidad de medida. Así, se cree que muchas proteínas se pliegan

en escalas de tiempo de micro al milisegundo, y en muchos casos las etapas más

importantes pueden pasar en el lapsus del microsegundo, tiempos estos demasiado

pequeños para permitir el seguimiento experimental del plegamiento.

Así pues, el mecanismo cinético del plegamiento de una proteína dista de estar

claro. Durante mucho tiempo se asumió como cierto que existian solo 2 estados: el

nativo y el desnaturalizado. El paso de uno a otro sería vía un estado de transición y no

existirían intermedios de ningún tipo, al menos ninguno que un tiempo de vida

suficiente como para poder ser detectado experimentalmente. Como mucho se acepta,

dentro de este modelo la existencia de un estado privilegiado con un tiempo de

residencia significativo que sería el “molten globule”, que vendría a ser como una

estructura nativa desordenada, con los elementos fundamentales del empaquetamiento

ya definidos, pero carente de detalle fino en la estructura. La proteína se plegaría muy

rápidamente para llegar al “molten globule”, pero tardaría más en hacer las

reorganizaciones locales que darían lugar a la definición de la estructura terciaria nativa

de la proteína.

Figura 4. Perfíl energético típico de un modelo de plegamiento en dos estados.

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Figura 5. Perfil de desnaturalización (seguido por fluorescencia) característico

de una proteína que se pliega según modelo de 2 estados.

En algunas proteínas ha quedado demostrado la existencia de intermediarios en

el proceso de plegamiento (modelo múltiples estados), que en algunos casos son tan

estables que han podido ser estudiados independientemente. Estos intermediarios

pueden ser “in the path”, es decir estructuras parcialmente plegadas, que por diversas

razones necesitan un aporte extra de energía para llegar a la forma nativa. También

pueden ser “out of the path”. En estos casos, comunes, por ejemplo en proteínas que

deben formar puentes disulfuros, o bien que deben hacer isomerizaciones de enlaces

peptídicos, la formación del intermediario atrapa al plegamiento en un mínimo local, lo

que implica la necesidad de un gran aporte de energía para escapar de él y retornar a la

ruta de plegamiento.

Figura 6. Esquema de un modelo cinético de “quasi” dos estados (arriba) y uno

de tres estados, conde la presencia de un intermediario induce “trapping” del proceso de

plegamiento.

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Recientemente han ganado importancia las teorías del plegamiento en un estado

o “downhill folding”. Estas teorías dicen que la proteína existe únicamente en la forma

nativa y que las formas desplegadas no son más que excitaciones del mínimo. Es decir

que el plegamiento es un proceso expontáneo que pasa “colina abajo”, sin barrera de

activación hasta la forma nativa. La velocidad del proceso de plegamiento viene

entonces controlada simplemente por un término de difusión. Los apoyos de los

modelos de “downhill folding” vienen de estudios muy detallado de termogramas (por

ejemplo variación de coeficiente calorífico con la temperatura) de algunas proteínas.

Parece ser que es un mecanismo cinético correcto en un pequeño número de proteínas,

casi siempre muy ricas en alfa-helice, siempre pequeñas y siempre que se pliegan en

etapas de tiempo muy corto (entre el micro y el milisegundo).

Figura 7. Representación gráfica de un proceso de plegamiento según el paradigma de

“downhill folding”.

MODELOS DE PLEGAMIENTO

A lo largo del tiempo se han desarrollado modelos teóricos para visualizar como se

produce el plegamiento que intentan complementar lo que se puede describir por los

modelos cinéticos, que son en definitiva fenomenológicos.

Modelos clásicos de plegamiento:

I. Modelo del rompecabezas (jigsaw puzzle). Diferentes moléculas se pliegan de

manera diferente y solo convergen las rutas en el estado nativo.

II. Modelo del armazón (framework). Se forman los elementos claves de estructura

secundaria que difunden hasta dar la forma nativa

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III. Modelo clásico de nucleación. Una serie de residuos próximo nuclea, forma

estructura secundaria y alrededor de este nucleo se estructura la proteína.

IV. Modelo de colapso hidrofóbico. La proteína colapsa rápidamente por sus

residuos hidrofóbicos dando una estructura compacta que luego se

reorganizara para dar la forma nativa.

V. Modelo de nucleación-condensación. Se forma un nucleo difuso no estable, sin

estructura secundaria sobre el que colapsa la proteína formándose la

estructura secundaria y terciaria casi simultáneamente.

Recientemente y gracias en gran medida a simulaciones con modelos teóricos reducidos

se ha desarrollado un interesante modelo integrador denominado “entropy funnel”. De

acuerdo con este modelo:

• El plegamiento se entiende como un movimiento en un paisaje energético

(“energy landscape”).

• No hay una única ruta sino muchas que van convergiendo formándose diferentes

interacciones nativas

• Al ir avanzando se va reduciendo la amplitud del espacio conformacional de la

cadena (i.e. cada vez menos entropía) y se va mejorando la energía potencial.

• Es un modelo que permite integrar y generalizar características de diversos

modelos clásicos.

Conceptualmente podemos asimilar el plegamiento a un proceso en el que la proteína va

cayendo (de diversas maneras) en un embudo cada vez con menos libertad

conformacional, pero con más estabilidad energética.

Figura 8. Esquema simplificado del modelo de plegamiento en “entropy funnel”.

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El modelo del entropy funnel puede sofisticarse para englobar diferentes aspectos del

plegamiento y permite obtener una explicación razonable de la paradoja de Lenvinthal

ya que durante el plegamiento se va reduciendo el espacio configuracional accesible

disminuyendo en la práctica los estados accesibles en la práctica, lo que conduce a una

drástica reducción del tiempo teórico de plegamiento.

Figura 9. Generalización del modelo del entropy funnel para explicar plegamientos

complejos.