TINCIÓN GRAM

FUNDAMENTO

FundamentoEs un tipo de tinción diferencial empleado en microbiología para la visualización de bacterias.Debe su nombre al bacteriólogo danés Christian Gram, que desarrolló la técnica en 1884. Las bacterias Gram-positivas y Gram-negativas tiñen de forma distinta debido a las diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares

FundamentoLa pared de la célula Gram+ es gruesa y consiste en varias capas interconectadas de Peptidoglicano así como algo de ácido teicoico. Generalmente, 80%-90% de la pared de la célula Gram+ es Peptidoglicano.

FundamentoLa pared de la célula Gram- contiene una capa mucho más delgada, únicamente de peptidoglicano y está rodeada por una membrana exterior compuesta de fosfolípidos, lipopolisacáridos, y lipoproteínas.Sólo 10% - 20% de la pared de la célula Gram- es peptidoglicano.

Fundamento.El cristal violeta es un colorante que penetra la pared celular de bacterias, tanto Gram + como Gram - Posteriormente se agrega el lugol que es mordiente y se forma un complejo con el cristal violeta.Durante el proceso de decoloración con alcohol-acetona, la gruesa pared celular de los Gram+ impide la salida del colorante manteniendo la coloración violeta

Pared de bacterias.

MATERIALES

MaterialesAsa de siembra.Portaobjetos y cubreobjetos.Muestras de bacterias (yogur, sarro dental etc. Sirven las usadas en la práctica del cultivo)Cristalizador.

Agitadores de vidrio u otro tipo de soporte.

MaterialesFrasco lavador.Colorantes.

Violeta de genciana o cristal de violeta.Safranina o fucsia básica.

Alcohol o mezcla alcohol-acetona.Lugol.Microscopio.Aceite de inmersión.

Objetivo de inmersión

Es un objetivo del microscopio de 100 aumentos que se pone casi en contacto con la muestra, sumerjido en una gota de aceite que hemos puesto sobre el cubreobjetos.

MECANISMO

MecanismoSe ralizarán varios frotis en distintos portaobjetos con diferentes muestras de los cultivos que preparamos en la práctica anterior.Todo lo descrito a continuación, se hará para las distintas muestras.

Fijación de frotisEsterilizar al mechero un asa de siembra y esperar a que enfríe un poco.Tomar con el asa un poco de la muestra.Extender la muestra con el asa sobre una gota de agua en un portaobjetos realizando una espiral en el centro.Esperar a que seque al aire libre o ayudarse del mechero teniendo en cuenta que el calor no debe ser directo.Se pasará el portaobjetos sobre la llama con movimientos de vaivén.Nunca se calentará tanto que no se pueda poner sobre el dorso de la mano.

Tinción y enjuagueUna vez seco, se echan sobre el frotis 3 o 4 gotas de violeta de genciana o cristal de violeta y se deja actuar durante un minuto (algo más si la temperatura es muy inferior a 23 grados)Deberá reposar sobre un recipiente sujeto por rejilla o agitadores de vidrio.Transcurrido el tiempo, se debe lavar la lámina al grifo o con frasco lavador.El agua debe caer desde arriba suavemente en chorro fino, nunca directamente sobre la muestra.El porta debe estar inclinado hacia abajo.

Tinción y enjuague

Reposo durante un minuto Lavado con vaso lavador

Mordiente y decoloración

Ahora se aplica como mordiente lugol durante 1 minuto.El mordiente es cualquier sustancia que forme con el colorante un compuesto insoluble y determine su fijación a las bacterias.Se usa Lugol que es yodo (I2) en equilibrio con KI (yoduro potásico) El I2 entra en las células y forma un complejo insoluble con el azul de genciana o el cristal de violeta.

Mordiente y decoloraciónSi ahora se observaran al

microscopio, con aceite de inmersión, se verán todas las células azules, tanto las Gram+ como las Gram-. Pasado el minuto, se decolora el frotis con alcohol o una mezcla de alcohol-acetona, con cuidado, dejándolo escurrir sobre la muestra hasta que el líquido escurra transparente, sin color azul.

DecoloraciónAlgunos organismos (los Gram+) no se decoloran, mientras que otros (los Gram-) lo hacen.  En bacterias Gram-, la mezcla de alcohol/acetona (que es un disolvente lipídico) disuelve la membrana exterior de la pared de la célula (y también puede dañar la membrana citoplasmática a la que se une el fino Peptidoglicano).La delgada capa de Peptidoglicano es incapaz de retener el complejo cristal violeta-yodo y la célula se decolora.

DecoloraciónLas células Gram+, a causa de sus paredes celulares más espesas (tienen más Peptidoglicano y menos lípido), son impermeables al disolvente ya que éste deshidrata la pared celular y cierra los poros, disminuyendo así el espacio entre las moléculas y provocando que el de complejo cristal violeta-yodo quede atrapado dentro de la pared celular.Después de la decoloración las células Gram+ son todavía azules, pero las Gram- son incoloras.

Lavado y tinción de contraste

Ahora vamos a hacer una tinción de contraste con un colorante rojo (safranina o fucsina) para poder observar todas las bacterias a la vez. Recordemos que las Gram – nos han quedado incoloras y no las podemos ver.

Lavado y tinción de contraste

Se lava con agua para quitar los restos de alcohol.Se deja secar el porta al aire libre.Ahora se procede a la tinción de contraste utilizando, por ejemplo safranina o fucsina básica y se deja actuar durante un minuto.Pasado el minuto, se enjuaga el porta con agua con el mismo método que la vez anterior.Se deja escurrir el agua y se seca al aire.

Observación.Se coge la muestra y se pone encima un cubreobjetos.Se le echa por encima una gota de aceite de inmersión.Se observa con el microscopio de 100 aumentos, con cuidado de que no lo acerquemos demasiado al cubre y lo rompamos.Veremos que las bacterias Gram+ permanecen azules y las Gram- aparecen rojas.

Gram+

Cocos Gram+ y bacilos Gram-

Gram-

El cristal violeta

penetra en todas las células

bacterianas a través de

la pared bacteriana.

El Lugol actúa de mordiente, haciendo que

el cristal violeta se fije

con mayor intensidad a

la pared de la célula

bacteriana. El I2 entra en las

células y forma un complejo

insoluble en solución

acuosa con el cristal violeta.

Alcohol-acetona,

sirve para realizar la

decoloración, ya que en la misma es soluble el complejo I2/cristal

violeta. Los organismos

Gram positivos no

se decoloran, mientras que los Gram

negativos sí lo hacen.

Para poner de

manifiesto las células

Gram negativas se utiliza una coloración

de contraste.

Habitualmente es un

colorante de color rojo, como la

Safranina o la Fucsina.

Explicación

Factores que considerar en la tinción de Gram

No se debe sobrepasar los tiempos de tinción y decoloración.Los cultivos viejos hacen que las bacterias Gram+ se tiñan parcial o totalmente de color rosa.Hay que tomar en cuenta que el agua usada en el frotis se encuentre en el rango de Ph 7-7.8 ya que:

Los Gram+ pueden hacerse Gram- al aumentar la acidez.Los Gram- pueden hacerse Gram+ al aumentar la alcalinidad.