4 Laboratorio Actual • No. 44 • Noviembre de 2013

M I C R O B I O L O G Í A

CASO CLÍNICO: TINCIÓN DE GRAM ENSANGRE PERIFÉRICA PARA EL ESTUDIODE FIEBRE DE ORIGEN DESCONOCIDO

Margaret Ordóñez Smith de Danies*, Gustavo Garnica Quintero**, Emily Danies Ordóñez***,Jorge Mario Rodríguez Fernández****.

RESUMEN

Paciente femenina de 21 años con cuadro clínico de fiebre persistente por mes y medio asociado a fractura de cráneo secundaria a accidente auto-

movilístico. Consultó tres centros de salud sin poder es-clarecer el factor etiológico, a pesar de hacerle múltiples hemocultivos para gérmenes aerobios que bajo los es-tándares de Bacteriología, todos fueron negativos. Ade-más se realizaron varios estudios diagnósticos y manejo de múltiples tratamientos.

El médico tratante asegura un mal pronóstico osci-lando entre 3 a 5 días fallecía. Se realiza un hemocultivo modificado para bacterias anaerobias estrictas, faculta-tivas, aerobias y hongos, y a la vez se hace un frotis de sangre periférica de sangre total para la tinción de Gram. Se observan a 100X estructuras de hongos y bacterias, iniciándose el mismo día tratamiento antimicótico. A los dos días siguientes se confirma el crecimiento de Serra-

tia marcescens y a los 10 días de Candida albicans. La paciente al finalizar el tratamiento tiene resolución com-pleta del cuadro clínico.

Dada la simplicidad, facilidad, rapidez y efectividad de esta técnica diagnóstica económica, se desea resaltar la utilidad de realizarla en escenarios clínicos con casos de fiebre de origen desconocido como lo puede ser las unidades de cuidado intensivo, salas de urgencia y hos-pitalización.

Palabras clave: Fiebre de origen desconocido, Fro-tis de Gram, Sepsis bacteriana, Candidemia.

TRABAJO ORIGINAL

INTRODUCCIÓN

El objetivo de presentar esta nueva técnica de “Fro-tis de Gram en sangre total para septicemias y bactere-mias”, es dar a conocer un análisis muy sencillo, rápido, útil, económico y valioso en el cual después de 5 a 10 minutos permite dar un diagnóstico en los casos de una bacteremia o septicemia. Considerando el manejo en equipo con el cuerpo médico, permite informar cuál es el germen causal y de esta manera iniciar tratamiento empírico, ahorrando días de estancia hospitalaria, evi-tando el uso indiscriminado de antibióticos de amplio espectro y obteniendo economía por parte de medica-mentos y exámenes de diagnóstico prolongados (1).

En las sepsis siempre se debe de esperar mínimo dos a tres días porque no es factible que todos los labo-ratorios tengan un equipo costoso para que les infor-me en 48 a 60 horas el tipo de germen. El reporte del Gram de los hemocultivos positivos es de gran ayuda,

* Microbióloga y Bacterióloga de la Universidad de Los Andes, Especialización en Microbiología e Inmunología de la Universidad Federal de Río de Janeiro, Brasil, Master en Microbiología de la Pontificia Universidad Javeriana y Doctorado en Biología de la Atlantic International University, EU. Directora Instituto de Micro-biología Colombiano Ltda. institutodemicrobiologia@yahoo.com** Médico, Neurólogo y Neurocirujano de la Pontificia Universi-dad Javeriana y Nancy-Université de Francia, fallecido el 26 de agosto de 2005.*** Médica General de la Pontificia Universidad Javeriana. Asis-tente de investigación en NYU -Universidad de New York, Lango-ne Medical Center, EU emilydanies@gmail.com**** Médico General de la Pontificia Universidad Javeriana. Cien-tífico asistente en investigación NYSPI- Columbia University Me-dical Center NY. EU jorge.rodf@gmail.com

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con la nueva técnica no exige tiempo de espera para obtener el crecimiento del cultivo para dar un informe inicial (2, 3). Dentro de las guías prácticas de los laboratorios clí-nicos no se realiza un Gram o frotis directo de la sangre total (4). En los únicos casos que usamos sangre seca es cuando se busca parásitos con la gota gruesa o para ver la morfología de las células en el frotis de sangre periférica y se colorea con Wright (5). La propuesta es que esta nueva técnica de colorear con Gram la sangre total, se estandarice a nivel mundial para que todo labo-ratorio clínico o de Microbiología la pueda hacer, pues no requiere de tecnología de avanzada ni de equipos costosos.

MATERIALES Y MÉTODOS

CASO CLÍNICO Paciente femenina de 21 años, natural de Bello, An-tioquia procedente de Bogotá quien ingresa a la Clínica Palermo con un cuadro de 15 días de evolución consis-tente en fiebre de 38.5˚C con un antecedente de trauma cráneo encefálico y hematoma subdural secundario a accidente autovolístico (23 de junio de 1982). La pa-ciente fue atendida inicialmente en la Clínica Nicolás de Federman y posteriormente en el Instituto Neurológico con varios hemocultivos negativos realizados en cada centro de salud.

A los 15 días del accidente ingresa levemente ta-quicárdica, febril (38.5˚C), orientada y con examen neurológico normal. Paraclínicos que muestran cuadro hemático normal, líquido cefalorraquídeo (LCR): nega-tivo, parcial de orina (PO): negativo, antígenos febriles: negativos (a los 19 días del accidente), hemoparásitos: negativos por 7 días consecutivos, cultivo de garganta con Escherichia coli, hemocultivos negativos por 16 días. Tratamientos: recibe tratamiento antimicrobiano por 2 días con gentamicina y luego 6 días con cefalexina y cloranfenicol.

En la segunda hospitalización en la Clínica Palermo (a los 23 días del accidente) continua febril 38.5˚C, de-sorientada temporo espacialmente. Es tratada con linco-micina y cloranfenicol por 12 días.

A los 35 días del accidente continúa con la fiebre de 38.5˚C. Se encuentra en LCR Staphylococcus (no reportan su especie), en frotis de garganta hay Klebsiella oxytoca, realizan otros 10 días de hemocultivos conse-cutivos y todos negativos. Se da por 6 días clindamicina y sisomicina.

A los 47 días del accidente continúa con fiebre de 38.5˚C, diarrea, ictericia, proteínas séricas de 4.09 gr%, leucocitos de 11.800 mm3, Hematocrito de 25%, He-moglobina 8.1 g%, linfocitos atípicos 5%, antiestrepto-

lisina O (ASO) de 625 UI, en el cultivo de garganta está la presencia de la Klebsiella oxytoca y Streptococcus no hemolítico.

A los 52 días del accidente se hace un frotis de san-gre periférico para colorear con Gram y se observan blastoconidias, micelios y bacilos Gram negativos (Fi-guras No. 1 y 2). Inmediatamente se da el tratamiento con Micostatin (Nistatina) 1gr/8 h. La paciente a los dos días mejora ya no tiene fiebre y a los dos días de la toma de los cultivos se confirma el crecimiento de Se-rratia marcescens y el antibiograma correspondiente al día siguiente sensible a Netromicina. Luego a los 10 días hay la presencia de Candida albicans. La paciente al finalizar el tratamiento tiene resolución completa del cuadro clínico.

Figura No. 1. El frotis de sangre para hacer la coloración de Gram.

Figura No. 2. Imagen al microscopio óptico a 100X del frotisdirecto de la sangre total con las blastoconidias,

micelios y bacilos Gram negativos.

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RESULTADOS

DESCRIPCIÓN DE LAS TÉCNICASDE LABORATORIO

La técnica nueva de realizar un frotis de sangre total o sangre periférica y colorearlo con la tinción de Gram, nació un miércoles de junio de 1982, al presentarse el cuadro de una paciente con fiebre de origen descono-cido manejada con múltiples tratamientos antibióticos sin mejoría manejada en prestigiosas instituciones.

Una colega solicita que: “se le haga un hemoculti-vo anaerobio estricto porque una familiar de 21 años tuvo una fractura de cráneo, tiene fiebres de 38˚C - 40˚C y ningún antibiótico le ha funcionado; está que se muere porque le han realizado unos 40 o más he-mocultivos desde hace mes y medio en prestigiosas instituciones y ya le dijeron al marido que le avisara a los parientes para el entierro porque no creían que vi-viría más de 3 a 5 días”. Cuando se le tomó la muestra se realizó cultivos para anaerobios, facultativos, aero-bios y hongos, y se hizo el extendido de frotis perifé-rica de sangre recién tomada de la vena, aunque no es una técnica estándar. La paciente estaba totalmen-te inconsciente, fue bastante difícil la toma de sangre tocó de la pierna.

Gram: En el caso de fiebres altas, es muy útil el frotis de la sangre, se puede hacer al puncionar el dedo o de la vena cuando se van a realizar otros análisis. Y de ahí extraer una gota para realizar un extendido como si fue-se un frotis de sangre periférica. (1, 6, 7). Luego se fija con calor o metanol y se hace la Coloración de Gram (Violeta de Gram, Lugol de Gram, alcohol acetona y safranina) (8) (Figura No. 1). Se observa con aceite de inmersión a 100X las estructuras de los hongos y bacte-rias (Figura No. 2).

Cultivos: Inmediatamente se tomó la muestra de sangre de la paciente, se inocularon varias gotas de sangre en los diferentes medios de cultivo sólidos y lí-quidos. Y en los sólidos se hizo aislamiento con el asa bacteriológica en forma de agotamiento. No se empleó los medios estandarizados para hemocultivos como las botellas de Ruiz Castañeda por no tenerlas en ese mo-mento.

Se incuban los medios de cultivo en varios ambien-tes atmosféricos: aerobios (agar sangre, agar McConkey, agar XLD, agar CLED con indicador de Andrade, agar selectivo para Gram positivos y negativos); en faculta-tivo el caldo tioglicolato y agar chocolate; y en la jarra de anaerobiosis con el gas generador correspondiente el caldo Schaedler, Medio de Carne Cocida y el agar Wil-kins Chalgren y para hongos el agar Sabouraud y agar Dermasel. A los dos días, creció en el agar chocolate la Serratia marcescens. Pasados 10 días en el agar Sa-bouraud la Candida albicans (Figura No. 3). Las iden-

tificaciones de los gérmenes se hacen de acuerdo a las normas de Microbiología (9, 10, 11).

Antibiograma por el método de difusión en disco: Dicho procedimiento se realizó de acuerdo a la estandarización de Kirby Bauer y CLSI (Clinical Labora-tory Standards International) (antes NCCLS) en 3 cajas de Petri con agar Mueller Hinton, cada caja con 8 an-tibióticos diferentes y dieron 23 antibióticos resistentes. Se obtiene la sensibilidad a la netromicina. (10, 11).

DISCUSIÓN

Los diagnósticos diferenciales fueron:

• Cráneo encefálico y fractura de cráneo con posible hematoma subdural.

• Meningitis.• Hemoparásitos.• Fiebre tifoidea o paratifoidea.• Fiebre reumatoidea.• Brucellosis.

Diagnóstico final

Septicemia por Candida albicans y Serratia marces-cens.

La septicemia es una de las principales causas de morbilidad en las unidades de terapia intensiva, se origi-na por bacterias, hongos o virus, los agentes causales son las bacterias Gram negativas, las endotoxinas constitui-das por lipopolisacáridos origina el síndrome de respues-ta inflamatoria sistémica. Otras reacciones similares se deben a exotoxinas de bacterias Gram positivas, las cua-les están compuestas por: peptidoglucanos, ácido lipotei-coico, lipoproteínas, ADN, glucolípidos, fragmentos de la pared celular, enterotoxinas, proteasas, virus y levaduras (12). Bacteremias se definen como presencia de bacte-

Figura No. 3. Cultivo de la Candida albicans.

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rias viables en sangre, confirmada por medios de cultivos y puede ser transitoria Ruimy R. et al. (13) afirman que la presencia de una bacteria como el Staphylococci en un extendido no significa que se diagnostique una bac-teremia, porque puede haber cocos Gram positivos coa-gulasa negativo de la piel. En Estados Unidos Flayhart D. et al., presentaron un estudio (14) en que atribuyen la mortalidad del 20% al 50% a las bacteremias.

Estudio microbiológico

La coloración de Gram ha sido una tinción muy útil desde hace muchos años. Appelbaum (15) describe en orinas el Gram cuantificado y es muy preciso para po-der saber el tipo de bacteria y es claro que conocien-do el Gram se puede dar el tratamiento apropiado. (15,16,17,18,19).

La realización de esta nueva técnica permitió escla-recer el diagnóstico de manera pronta al igual que el inicio del tratamiento. La etiología de la resistencia de la Serratia coincide con Bodey GP (20) que encontró con esta bacteria en septicemias, con un patrón de resisten-cia antimicrobiana en pacientes de cáncer en los Estados Unidos. En el Japón Ikegaya S. et al. (21) reportaron un paciente de 77 años con diagnóstico de septicemia por Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus me-ticilino resistente con refractariedad al tratamiento, hicie-ron un análisis de frotis de sangre periférica observaron pseudohifas, inmediatamente inician antimicóticos aun-que lamentablemente murió. Después de varios días en el hemocultivo creció Candida albicans y en su autopsia se observaron los hongos.

Desde hace varios años se sabe que la Candidemia produce bastante morbilidad y mortalidad sobre todo en los pacientes inmunocomprometidos (22, 23, 24, 25, 26, 27) o cuando han tomando antibióticos la flo-ra intestinal se descompensa y comienza la diarrea, en el estudio de gastroenteritis se encontró un 41.2% de Candida albicans y 21.1% de Candida no albicans (28). Nuestra paciente también presentó diarrea (en el día 47 de su accidente autovolístico) porque se le habían dado varios antibióticos.

Elouennass M. et al. 2008 (29) en Francia estudiaron entre el 2002 al 2005 la incidencia de las bacterias en una unidad de cuidado intensivo y se encontró que el 49.3% eran por bacterias Gram negativas y el 46.85% por cocos Gram positivos. La bacteria más frecuente fue Acinetobacter baumannii (13.63%), Staphylococcus aureus (12.6%), Staphylococcus epidermidis (12.6%),y Pseudomonas aeruginosa (7%). En Colombia Ordóñez

Tabla No. 2. Incidencia a nivel mundial de la septicemia y las bacterias aisladas.

Tabla No. 1. Incidencia de los gérmenes aislados en los hemocultivos de la Clínica Pediátrica Eusalud de Ordóñez Smith M. et al. 2012 (30).

BacteriaNúmerode casos Porcentaje

Staphylococcus aureus 3 5.0

Staphylococcus no coagulasa 44 73.3

Streptococcus no hemolítico 1 1.6

Escherichia coli 4 6.6

Enterobacter cloacae 2 3.3

Citrobacter freundii 2 3.3

Klebsiella pneumoniae 2 3.3

Klebsiella oxytoca 2 3.3

Total 60 99.7

Fecha Autor País/Población Incidencia Porcentaje

2012 Viswanathan (31) IndiaNeonatos en rural y urbanourbano

Klebsiella pneumoniaeGram negativos nofermentadores

38.342.1

2012 Ordóñez Smith M. et al. (30) Colombia

Clínica Pediátrica

Staphylococcus nocoagulasaEscherichia coliStaphylococcus aureus

73.3

6.05.0

2012 Micek S. et al. (32) Estados Unidos Escherichia coliKlebsiella pneumoniae

30.823.2

2012 West B. A. et al. (33) Africa sub-SaharaNeonatos

Klebsiella pneumoniaeStaphylococcus aureus

58.020.4

2012 Suárez-García (34) EspañaUn caso de bacteremia

Lactobacillus jensenii Un caso

2011 Shorr AF et al. (35) Estados Unidos hospitalizados Escherichia coliPseudomonas sp

55.117.1

2011 Serhan A. A. et al. (25) Jordaniahospitalizados

Staph epidermidisGram negativos

4735

(Continúa)

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Fecha Autor País/Población Incidencia Porcentaje

CandidaCultivo mixtoEnterococcusStaphylococcusBacillusDifteroides

54.52.81.01.41.4

2008 Elouennass (29) FranciaServicio de reanimación

Gram positivasGram negativas

46.8549.3

2006 Morrison (36) Estados Unidos con cáncer Gram positivas(Staphylococcus)Gram negativas (E. coli)Hongos

424513

2006 Bodey (20) Estados Unidos con cáncer Serratia sp 52

2005 Espino Hernández M. et al. (37) CubaNeonatos

Cocos Gram Positivos 66.3

2005 Berkley (38) Kenya AfricaNeonatos

Escherichia coliStreptococci Grupo B

1411

2004 Muller-Serieys (39) FranciaBacteremia Gram Negativas

Escherichia coliKlebsiella spp

53.312.2

1998 Zamora (40) MéxicoNeonatos

Cocos Gram Positivos 55

S. M. et al. (30) realizaron un estudio en una clínica pe-diátrica con pacientes desde neonatos hasta 12 años con una alta incidencia de las bacterias Gram positivas. Tabla No. 1. Veamos cómo a nivel mundial se observa la etiología de las septicemias en la Tabla No. 2, cinco de los catorce autores enunciados obtuvieron más casos de septicemia con bacterias Gram positivas y nueve de los catorce con Gram negativas. Por lo tanto, hay gran va-riabilidad de etiología bacteriana por eso es importante antes de dar el tratamiento hacer el Gram de la sangre total.

CONCLUSIONES

De acuerdo a nuestro caso clínico y de otros auto-res es bastante probable tener septicemias micóticas, en especial post-tratamientos antimicrobianos. El presente trabajo sugiere la posibilidad de realizar un frotis de san-gre total para el estudio del paciente con fiebre desco-nocida, posiblemente este y futuros estudios muestren la importancia de aplicar esta técnica en urgencias y en cuidados intensivos, lo ideal es prevenir el uso de trata-mientos empíricos sin un fundamento claro que pueden llevar a agravar la sintomatología del paciente séptico. Asimismo, todo laboratorio clínico con o sin recursos económicos debe tener en cuenta esta nueva técnica como parte de los procedimientos estándares. Si se tra-bajan con medios tradicionales se puede sembrar con gotas de sangre directamente y hay una probabilidad de obtener los gérmenes. Sería importante hacer un es-tudio comparativo de los hemocultivos en las botellas

(Continuación Tabla 2)

tradicionales con los medios sólidos. Los hemocultivos son demorados y dicho tiempo puede tener implicacio-nes nefastas para el paciente. Siempre debemos pensar en salvar vidas y eso se logra con un resultado oportuno y veraz. ¿Cuántos casos no se podrán salvar por hacer un simple frotis de sangre en un caso de fiebre elevada?

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