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在一个具有显著滤泡细胞的卵室内，随卵母细
胞的生长发育，卵黄区延伸成一系列由小到大
的卵室。当卵黄发生时，卵母细胞胞核开始膨
胀，转变为胚泡，卵黄沉积阶段结束时，胚泡膜
破裂，卵母细胞与滤泡细胞互相脱离，以便前者
排出进入萼区（图 !）。滤泡细胞可能为卵母细
胞发育提供营养，并参与分泌卵壳的形成［""］。
腰带长体茧蜂采用被动防御方式逃避寄主
血细胞的免疫，其成熟卵表面存在 " 层纤维层，
这种纤维层结构在寄生蜂发育过程中起着重要
的免疫保护作用［#］。本实验在萼区内壁发现有
纤维状物质，推测这可能与卵表面的纤维层结
构形成有关。
目前国际上对分泌毒液的毒液器官的形态
和超微结构只在很少的蜂科中有过研究，而国
内对毒液器官的研究工作才刚刚开展［"$］，至于
寄生蜂（如腰带长体茧蜂等）毒液器官的作用及
其调控机理则仍然需进一步的研究。
参 考 文 献
" 何俊华，楼晓明 % 昆虫知识，"&&’，!"（!）："(( %
# )* +%，,-* .% .%，/* 0% +% ! % "#$%&’ ()*$+,- %，#$$!，#$，
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! 345 67897 +%，:;7< =% >5：:;7< =%（7?%），375@AB @C D-7
)EA75@FD784% G7H I@8<：JK4?7A;K :87BB，"&L(%"1 2 MM %
M N?B@5 O% 6%，3;5B@5 P% Q% ./# % 0#’ %，"&1&，%%%（&）：
" $"! 2 " $#M%
’ 何俊华，陈学新，马云 % 中国动物志，第 "L 卷，昆虫纲 % 北
京：科学出版社，#$$$ % M(& 2 M1!%
( R*;<7 S% T% +% >5：R*;K<7 S% T% +%（7?%），:484B;D;K 04BF%
T@5?@5：U-4FA45 V )499，"&&1%"(! 2 "(’%
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"$ 潘健，陈学新 % 电子显微学报，#$$!，""（M）：#&L 2 !$!%
"" 吴畏，赵云龙 % 上海师范大许学报（自然科学版），#$$"，
!&（!）：(1 2 1"%
!科技部重大基础研究前期研究专项（#$$!UUJ$"$$$）和新疆生物资源基因工程重点实验室开放课题（.+S.$#$"[#$$M$!）。
!! 通讯作者，N[A4;9：A4^;*K;_ ‘^*% 7?*% K5收稿日期：#$$’[""[#&，修回日期：#$$’["#[!$，再修回日期：#$$([$
!"# $%&’( !"#$%&’$( )*+#,")’++"- &./*+0($"#(， !"#$%&’’(’ )&*#’$"，)+,-$.!/0.+’1$.!/ )&*)’&#$’-， $-*’/’.#&$.%*.2-$"3 )*$"#
摘 要 研究准噶尔小胸鳖甲 !"#$%&’$( )*+#,")’++"- &./*+0($"#( 4!-( 抗冻蛋白 !15678 真核表达产物的
功能及理化性质。首先用硫酸铵浓度梯度沉淀初步纯化酵母真核表达产物，然后通过细菌低温保护实
验检测抗冻蛋白 !15678 低温保护功能，同时探讨抗冻蛋白 !15678 在酸碱环境和 9:: ;时的稳定性，
并通过等电聚焦凝胶电泳检测其等电点。研究表明 !15678 真核表达产物在低温下能够提高细菌的存
活率，能够耐受高温和一定程度的强酸强碱，其等电点约为 8<= 左右。准 噶 尔 小 胸 鳖 甲 抗 冻 蛋 白
!15678 真核表达产物与赤翅甲抗冻蛋白（>567）的比较表明拟步甲类昆虫抗冻蛋白具有相似的理化性
质。
关键词 准噶尔小胸鳖甲，抗冻蛋白，理化性质，等电点
?: 世纪 @: 年代末，>’A&$’- 在一种生活在
南极的鱼 2$’3(,%3*- 4%$#/0$’5"+6" 血液中首次
发现抗冻蛋白（!"#$%&’’(’ )&*#’$"，567）。目前，
已在多种生物中发现有抗冻蛋白，昆虫能够适
应北方陆地极端寒冷环境而生存所采取的策略
包括，除去与外界冰晶接触的水分，利用物理屏
障保护，也产生大量多元醇、糖类等渗透保护物
质以及产生抗冻蛋白适应低温环境。其中抗冻
蛋白是一类能够降低溶液冰点而不改变其熔点
的多肽，它能够抑制冰晶增长、改变冰晶形态、
抑制冰的重结晶［9］。
昆虫抗冻蛋白在空间结构方面不同于植物
和鱼类的抗冻蛋白，其热滞活性远远高于二
者［?］。对昆虫抗冻蛋白的研究集中在云杉卷叶
蛾 7/%$"-,%+’*$( 8*3"8’$(+(（ B/’1C）、黄 粉 甲
2’+’4$"% 3%9",%$ DC、赤翅甲 :’+&$%"&’- #(+(&’+-"-D!#&’$//’［E］等昆虫。从基因水平、蛋白结构及其
作用机制等方面的研究发现昆虫抗冻蛋白都具
有 FGF 的结构基序［H］。>21!" 等研究了阿拉斯
加的 I8 种昆虫，发现有 9= 种昆虫体内含有抗
冻蛋白［8］。新疆准噶尔盆地古尔班通古特沙漠
南缘的荒漠气温变化范围大，年温差和昼夜温
差大，这里地表温度可以达到 8: ;以上，年均
气温 @ J 9: ;，最热月均气温 ?H J ?I ;，极端
最高气温达 H:;以上，极端最低气温 K H: ;以
下［@］。准 噶 尔 小 胸 鳖 甲 !"#$%&’$( )*+#,")’++"-&./*+0($"#( 4!-( 在新疆准噶尔荒漠中广有分
布，以成虫过冬，春季复苏后立即交配产卵。抗
冻蛋白可能在其适应冬季寒冷气候安全过冬方
面有重要的作用。因此，在先前的研究工作中
我们 克 隆 了 准 噶 尔 小 胸 鳖 甲 抗 冻 蛋 白 基 因
3)!%)8［I］。该基因由 E:@ 个碱基组成，与已发
表的黄粉甲抗冻蛋白的最高相似性为 I=L，与
赤翅甲的最高相似性达 I?L，准噶尔小胸鳖甲
抗冻蛋白（!15678）的理论分子量为 9:<H M>!。分析推导的氨基酸序列发现，该蛋白含有 I 个
重 复 序 列（0B0F0GE0N0G80G@0B0G=0GO0G9:0G990F0），每个重复序列由 9? 个氨基酸组成，与赤翅
甲抗冻蛋白的重复序列极为相似［= ］。软件模
拟 !15678 抗冻蛋白空间结构发现，该蛋白具
有昆虫抗冻蛋白所特有的!K 螺旋结构，与黄
粉甲的抗冻蛋白结构相似都为左手螺旋。昆虫
抗冻蛋白的特殊结构可能与其特有的理化性质
和相应的功能有关。D$ 等发现赤翅甲抗冻蛋
白（>5670H）在 )P ? J 99 的范围内和 9:: ;的
温度下热滞活性几乎没有改变［O］。
为了验证我们在酵母中所表达的 !15678具有抗冻蛋白的生物学活性和昆虫抗冻蛋白的
特有理化性质，本研究以转化了 3)( %)8 抗冻蛋
白基因的毕赤酵母表达产物为材料［9:］，通过细
菌低温保护实验研究 !15678 的生物学活性，
通过酸碱处理和煮沸处理，分析 !15678 在不
同条件下的稳定性。实验结果表明，毕赤酵母
表达的 !15678 能够提高大肠杆菌在低温的
存活率，并且这种功能具有酸碱稳定性和高温
稳定性，研究结果将为昆虫抗冻蛋白的开发应
用奠定了基础。
·??=· 昆虫知识 B+$"’-’ Q2//’#$" *% R"#*1*/*3, ?::@ HE（@）
! 材料和方法
!"! 菌种
含有 质 粒 !"#$%!# 和 !"#$%!#&!"#’$(的毕赤酵母菌 )*+,,-.［,/］由本实验室保存，鼠
抗 ")0& !"#’$( 血清由本实验室制备。
!"# 试剂
分子量标准蛋白和羊抗鼠 12"&34$ 血清均
购自华美公司；丙烯酰氨、甲叉双丙烯酰胺、
567&89:;<=,/#>!?7@9:;、0A*A+ 均购自美国伯乐
公司；三羟甲基胺基甲烷和过硫酸铵购自上海
生工公司；其余常用试剂为国产分析纯。
!"$ !"#’$( 蛋白的制备
将 B C/ D保存的转化 !"#$%!#&!"#’$(质粒的毕赤酵母菌 )*+,,-.，在含 ,E %;7F6G的 H$+ 固体平板上通过三线法划线，I. D温箱
孵育 J. ?，挑取单菌落于 ,/ >8 含 ,E %;7F6G 的
H$+ 液体培养基中，I. D I// K=>6G 培养 J. ?。
按 ,L的接种量接种于 I// >8 含 ,E %;7F6G 的
H$+ 液体培养基中，I. D I// K=>6G 培养 J. ?。
,I /// K=>6G 离心 ,/ >6G，将上清转移至另一烧
杯中。
!"% 硫酸铵浓度梯度沉淀初步纯化 !"#’$(酵母表达产物
硫酸铵沉淀方法参照汪家政《蛋白质技术
手册》［,,］。向 I// >8 !"#’$( 酵母表达产物的
上清中依次加入质量分数为 ,/，I/，</，J/，(/，
-/，C/ 和 ./L的固体硫酸铵。经硫酸铵沉淀后
的 !"#’$( 蛋白样品用 , >8 磷酸缓冲液溶解。
)+)&$#"A 电泳检测溶解上清。将 </L硫酸铵
沉淀上清用孔径为 ,/ /// +M 的透析袋在 ,/>>7@=8 !3 CN/ 的 0K6O&3P8 缓冲液中透析 J. ?，
每 J ? 换 , 次透析缓冲液，制备得到 !"#’$(蛋白。
!"& !"#’$( 蛋白样品的免疫印记分析
将 !"#’$( 蛋白样品经 )+) & $#"A 分离
后再电转移至硝酸纤维素膜上。(L脱脂奶粉
封闭 I ?，依次加入鼠抗 ")0&!"#’$( 血清（室
温 I?、$5) 洗 < 次）及羊抗鼠 12"&34$（室温反
应 , ?、$5) 洗涤 < 次），最后加底物 +#5 显色并
拍照。
!"’ !"#’$( 蛋白的理化性质
!"’"! !"#’$( 蛋白样品的等电点检测：采用
567&4MQ *7Q;@ ,,, *6G6&1A’ P;@@ 检测 !"#’$(真核表达产物的等电点，电泳步骤参照说明书
进行。用已知等电点的牛血清白蛋白（5)#）、
核糖核酸酶和溶菌酶作为等电点标准蛋白。
!"’"# !"#’$( 蛋白的低温保护功能分析：参
照 %?MG2 的方法［,I］。取新鲜制备的大肠杆菌
#$I, !"AR&J0&, 一级菌液 ,//"8 接种于含 ,//
"2=>8 #>! 的 85 培养基中，<C D培养 ,/ ? 后
的菌液先用无菌双蒸水稀释 ,/J 倍，吸取 (/（8加 入 到 终 浓 度 为 (/ "2=>8 5)#、,/ "2=>8!"#’$(、</"2=>8 !"#’$(、(/"2=>8 !"#’$(和无菌水 ( 个处理中，终体积为 (//"8。涂平
板记数：在 B C D分别放置 /，IJ，J.，CI，S- 和
,I/ ?，吸取 I/"8 样品在含有 ,//"2=>8 #>! 的
85 平板上涂布，每个处理重复 < 块板，<C D培
养 ,I ? 后记数菌落数。
!"’"$ !"#’$( 蛋 白 酸 碱 稳 定 性 研 究：将
!"#’$( 蛋白分别溶于不同 !3（!3 ,N/，<N/，
,IN/，,JN/）的 ,/ >>7@=8 0K6O&3P@ 缓冲液中，JD处理 J ?，然后参照汪家政《蛋白质技术手
册》［,,］用等体积的 B I/ D无水乙醇沉淀蛋白。
再用 </"8 ,/ >>7@=8 0K6O&3P@（!3 CN/）缓冲液
溶 解 沉 淀 蛋 白，待 用。吸 取 大 肠 杆 菌 #$I,!"AR&J0&,（TU +-// ,NJ 稀释 ,/J 倍）(/"8 加入
终浓度均为 (("2=>8 的 !"#’$(、!3 ,N/，<N/，
,IN/，,JN/ 分别处理的 !"#’$( 和无菌水 - 个
处理中，终体积为 (//"8。同 ,N-NI 做涂平板
记数。
!"’"% !"#’$( 蛋 白 热 稳 定 性 研 究：将
!"#’$( 蛋白分别在沸水浴中处理 ,/ >6G 和
I/ >6G，待用。吸取大肠杆菌 #$I, !"AR&J0&,（TU+-// ,NJ 稀释 ,/J 倍）(/"8 加入终浓度为 ((
"2=>8 的 !"#’$(、煮 沸 ,/ >6G、I/ >6G 的
!"#’$( 和无菌水 J 个处理中，终体积为 (//
"8。同 ,N-NI 做涂平板记数。
!"’"& 数据处理：将处理组每天的菌落平均数
除以初始菌落的平均数，所得值为该处理组当
·<I.·I//- J<（-） 昆虫知识 P?6G;O; 5V@@;:6G 7W AG:7>7@729
图 ! !"!"#" 等电聚焦凝胶电泳图
$% 牛血清蛋白 &% 核糖核酸酶
’% 溶菌酶 (%!"!"#)（箭头所示）
的大肠杆菌第 ) * 的存活率为 ’+,左右，两者
都显著地高于对照处理水和无关蛋白 -.! 中
的细菌存活率（" / +%+)）。
图 # !"!"#" 低温保护细菌效果
!无菌水 "-.! #$+!0123 !"!"#)
$’+!0123 !"!"#) %)+!0123 !"!"#)
$%" !"!"#) 蛋白在不同 45 下的稳定性
如图 ) 所示，!"!"#) 蛋白（))!0123）经过
45 $、45 ’、45 $& 的缓冲液处理后，低温保护能
力有不同程度下降。45 $ 处理平均下降 ’+,、
45 ’ 处理平均下降 (+,、45 $& 处理平均下降
$+,左右，但它们对大肠杆菌的保护效果仍然
显著高于对照处理组（" / +%+)）。但经 45 $(处理 ) * 与对照水的大肠杆菌存活率差异不显
著（" 6 +%+)）。
$%& !"!"#) 蛋白的热稳定性
图 " !"!"#" 酸碱处理后低温保护细菌效果
"无菌水 !!"!"#) #45 $ 处理 !"!"#) ( 7 后
%45 ’ 处理 !"!"#) ( 7 后 & 45 $& 处理 !"!"#) ( 7 后
$45 $( 处理 !"!"#) ( 7 后
如图 8 所示，!"!"#) 蛋白经过 $++ 9处
理 $+ 2:;、&+ 2:; 以后，其低温保护效果与未经
热处理的 !"!"#) 蛋白保护效果相比平均下
降 (+,，但仍能使大肠杆菌在 < = 9的相对存
活率达 (+,左右，显著高于对照水处理的大肠
杆菌存活率（" / +%+)）。$++ 9处理 $+ 2:; 和
&+ 2:; 的 !"!"#) 蛋白的保护大肠杆菌的效果
差异不显著（" 6 +%+)）。
图 & !"!"#" 热处理后低温保护细菌效果
" 无菌水 ! !"!"#) & $++9处理 !"!"#) $+ 2:;
% $++9处理 !"!"#) &+ 2:;
! 讨论
硫酸铵浓度梯度沉淀实验证明 ’+,的硫
酸铵浓度沉淀能够初步纯化 !"!"#)，电泳检
测发现 ( 条蛋白条带，免疫印记实验表明 (+>?@ 的蛋白条带具有 !"!"#) 的抗原特异性。
等 电 聚 焦 电 泳 结 果 显 示，初 步 纯 化 的
!"!"#) 表达产 物 的 等 电 点 是 )%A 左 右，与
·)&A·&++8 (’（8） 昆虫知识 B7:;CDC -EFFCG:; HI J;GH2HFH0K
!"#$#" 软件分析 !"#%&’ 的等电点（()*+,-）
不同，一方面说明这可能是由于 !"#%&’ 经过
翻译后修饰，等电点发生了改变，另一方面也说
明软件分析推测的蛋白质等电点与实际测定的
等电点不一定相同。
对于避冻昆虫，抗冻蛋白可以使虫体的过
冷却点和冰点降低；对于耐冻昆虫，抗冻蛋白则
有利于抑制结冰和重结晶［,.］。抗冻蛋白能够
以吸附抑制的方式直接作用于冰晶，抑制冰晶
的形成及冰晶的重结晶，同时抗冻蛋白还能够
稳定细胞膜结构，保持细胞膜在低温下的稳定
性，从而减少低温时细胞受到的损伤［,*］。/0123等检测胡萝卜抗冻蛋白的低温保护活性时，证
明胡萝卜抗冻蛋白就可以显著地提高细菌的抗
寒性能［,4］，该结论与我们的实验结果相一致，
表明真核生物昆虫的抗冻蛋白能够在低温条件
下保护大肠杆菌免受损伤。
(5 ,、(5 .、(5 ,4 处理过的 !"#%&’ 仍具
有不同程度的低温保护功能，说明 (5 ,、(5 .强酸不能使 !"#%&’ 发生不可逆的变性，但不
能认为 (5 , 和 (5 . 的处理不会引起 !"#%&’的变性，!"#%&’ 可能在低温下缓慢地复性。
从图 ’ 看 (5 ,* 处理后蛋白低温保护能力迅速
降低，可能是蛋白质发生了不可逆变性导致其
保护功能丧失。67 等实验发现赤翅甲抗冻蛋
白 !#%&8* 在 (5 4 9 (5 ,, 的范围内热滞活性
没有 改 变，在 (5 , 的 条 件 下 热 滞 活 性 降 低
4’:［;］。实验证明 !"#%&’ 在一个较广的 (5范围内具有稳定性，说明 !"#%&’ 能够在昆虫
体 内 的 不 同 器 官 稳 定 存 在，这 种 性 质 对
!"#%&’ 的开发利用可能具有潜在价值。
!"#%&’ 在 ,<< =煮沸 4< >72 后仍然具有
对细菌的低温保护作用，说明 !"#%&’ 具有较
强的 热 稳 定 性。67 等 发 现 赤 翅 甲 抗 冻 蛋 白
（!#%&）在 4< 9 ,<< ?@ 的温度范围内孵育 ’>72 其热滞活性不发生改变［;］。A7BCDEFFE> 等报
道黑麦草中的抗冻蛋白在 ,<< =条件下具有稳
定性［,’］，这些结果与本实验结果相一致，说明
准噶尔小胸鳖甲 !"#%&’ 与赤翅甲虫抗冻蛋
白 !#%&8* 具有相似的理化性质，可能是因为
这 4 种拟步甲昆虫的抗冻蛋白都具有相似的氨
基酸序列并且同源性很高的缘故。抗冻蛋白的
热稳定性提示 #%& 可能还具有其他功能，由于
昆虫抗冻蛋白在结构上有排列规则的亲水基
团，推测可能与夏季炎热条件下的体内保持水
分有关，并且 !"#%&’ 的酸碱稳定性和热稳定
性可能与其结构中大量存在的二硫键有关。
致谢 感谢新疆大学生命科学与技术学院黄人
鑫教授对准噶尔小胸鳖甲进行鉴定。
参 考 文 献
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* 刘忠渊，张富春，王芸，吕国栋 I生物技术，4<<*，#&（.）：-.
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- 赵干，马纪，薛娜，杨长庚，张富春 I 昆虫学报，4<<’，&%（’）：NN- 9 N-.+
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·N4O· 昆虫知识 @072CLC MPTTCF72 EW ^2FE>ETE3J 4<<N *.（N）
