Marzo, 2018

Tandil

Facultad de Ciencias Veterinarias

—UNCPBA—

Evaluación de la protección conferida por Lactobacillus

reuteri como probiótico en pollos mediante

histomorfometría intestinal

Herrera, Juan Manuel; Huberman, Yosef; Felipe, Antonio

I

Evaluación de la protección conferida por Lactobacillus reuteri como

probiótico en pollos mediante histomorfometría intestinal

Tesina de la Orientación Producción Animal, presentada como parte de los requisitos

para optar al grado de Veterinario del estudiante Juan Manuel Herrera.

Tutor: Dr. Huberman, Yosef Daniel

Director: Dr. Felipe, Antonio Eduardo

Evaluador: Dr. Solana, Hugo Daniel

II

Doce años.

Doce años tardé en necesitar estos agradecimientos. Años de gente

nueva, compañeros y amigos, docentes, investigadores, animales y

caminos. Incontables horas de miles de páginas de apuntes y

fotocopias. Un par de centenares de horas de nervios y exámenes.

También, años de puertas abiertas, ventanas y pasadizos secretos —

más de los que pudiera haber imaginado.

Doce años de estudiar y explorar. Descubrir las ciencias veterinarias,

la investigación, la docencia, la multidisciplina y la extensión. La

veterinaria abierta y creciente. La docencia que me dejaron

experimentar en Genética e Histología. La extensión que me dio

muchas satisfacciones por cinco años ya —y seguirá, seguiremos, en

equipo. Todo lo que despertó algo en mí.

Pero las gracias serán tácitas, impersonales, individuales y grupales,

argentinas como extranjeras, formales como cotidianas.

El tiempo pasó. Muchos pasaron, otros continúan.

Los más importantes siempre estuvieron. Y aunque algunos hayan

llegado en mitad o hacia el final del camino y apenas lo comprendan,

son parte de los importantes, de los tredici a tavola.

III

Nel mezzo del cammin di nostra vita

mi ritrovai per una selva oscura,

ché la diritta via era smarrita.

Ahi quanto a dir qual era è cosa dura

esta selva selvaggia e aspra e forte

che nel pensier rinova la paura!

Tant'è amara che poco è più morte;

ma per trattar del ben ch'i' vi trovai,

dirò de l'altre cose ch'i' v'ho scorte.

—Dante Alighieri. La Divina Commedia. Inf. I, 1-9

IV

RESUMEN

El epitelio de la mucosa intestinal sirve de barrera permeable para nutrientes y actúa

como la primera línea de defensa contra patógenos (Christ y Blumberg, 1997; Strober,

1998), correlacionándose su histología con una adecuada función y óptimo desempeño

productivo (Nicoletti et al., 2010). La morfología y número de vellosidades y criptas

varían con la dieta (Humphrey y Turk, 1974; Yamauchi e Isshiki, 1991; Zanuzzi y

Barbeito, 2014) y los estímulos patógenos (Fernando y McCraw, 1973). En aves de

producción, las bacterias del género Salmonella son responsables de infecciones

agudas y crónicas, causando pérdidas económicas significativas (Swayne, 2013). Ya que

esta es una importante zoonosis y los productos avícolas sus principales fuente de

infección (Shivaprasad, 2000; Acha y Szyfres, 2001; Foley, Lynne y Nayak, 2008;

Swayne, 2013), existe gran presión para proteger a los consumidores. Nurmi y Rantala

(1973) describieron que la dosificación de contenido intestinal de pollos adultos sanos

a pollitos confiere protección contra Salmonella. Los probióticos son microorganismos

que confieren un beneficio en la salud del hospedador (FAO/OMS, 2006) y que son

utilizados como suplementos en la alimentación de animales y humanos (Marie y

Smith, 2014). Existe una extensa bibliografía sobre el empleo de probióticos en

producción avícola, siendo Lactobacillus uno de los principales géneros estudiados. Sin

embargo, a pesar de haber un consenso generalizado sobre el beneficio de utilizarlos,

existe variabilidad en los resultados. Los objetivos de la presente tesina son describir la

histomorfometría y las lesiones histopatológicas de duodeno de aves infectadas con

Salmonella spp. sometidas a dosificaciones de Lactobacillus reuteri como tratamiento

probiótico, y evaluar la protección conferida por esta bacteria frente a infecciones pre-

establecidas. No se observaron diferencias significativas en la histomorfometría

duodenal de los grupos en estudio, ni en la colonización sistémica por parte de

Salmonella spp. Se concluye que la cepa estudiada no presentaría ventajas

significativas de protección frente una infección pre-establecida de Salmonella spp. en

pollitos al día del nacimiento.

Palabras claves: Producción avícola, histomorfometría, probióticos, Lactobacillus,

Salmonella.

V

ÍNDICE

SIGLAS Y NOMENCLATURA VII

FIGURAS VIII

GRÁFICOS IX

TABLAS IX

I. INTRODUCCIÓN 1

OBJETIVOS 2

II. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 3

ANATOMÍA DEL SISTEMA DIGESTIVO DE LAS AVES 3

EL INTESTINO DE LAS AVES 5

Intestino Delgado 5

Intestino Grueso 6

HISTOLOGÍA DUODENAL 9

TÚNICA MUCOSA 10

TÚNICA SUBMUCOSA 19

TÚNICA MUSCULAR 19

TÚNICA SEROSA 19

SALUD INTESTINAL Y MICROBIOTA 21

MICROORGANISMOS PROBIÓTICOS 26

USOS Y BENEFICIOS 30

MECANISMOS DE ACCIÓN 33

EL CASO DE LACTOBACILLUS 35

SALMONELOSIS 38

GÉNERO SALMONELLA 39

IMPORTANCIA EN SALUD PÚBLICA 42

EPIDEMIOLOGÍA DE SALMONELOSIS AVIAR 43

ASPECTOS CLÍNICOS: SIGNOLOGÍA 46

ASPECTOS CLÍNICOS: LESIONES PATOLÓGICAS 47

DIAGNÓSTICO 49

VI

CONTROL Y PREVENCIÓN 50

III. MATERIALES Y MÉTODOS 54

APROBACIÓN DEL CICUAE 54

ANIMALES 54

INSTALACIONES 54

TRATAMIENTOS 55

PREPARACIÓN DEL PROBIÓTICO 56

PRUEBAS BACTERIOLÓGICAS COMPLEMENTARIAS 57

MUESTREO HISTOLÓGICO 59

TINCIÓN HISTOLÓGICA 61

CAPTURA DE IMÁGENES 62

ANÁLISIS HISTOMORFOMÉTRICO 63

ANÁLISIS ESTADÍSTICO 64

IV. RESULTADOS 65

RECUENTO BACTERIANO DEL INÓCULO PROBIÓTICO 65

OBSERVACIONES MACROSCÓPICAS 65

HISTOMORFOMETRÍA Y LESIONES MICROSCÓPICAS 66

PRUEBAS BACTERIOLÓGICAS COMPLEMENTARIAS 75

V. DISCUSIÓN 78

VI. CONCLUSIONES 86

VII. BIBLIOGRAFÍA 87

VII

SIGLAS Y NOMENCLATURA

UNICEN Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires

FCV Facultad de Ciencias Veterinarias

INTA Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria

CICUAE Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales de

Experimentación

XLD Agar xilosa, lisina, desoxicolato

ASC Agar sangre Columbia

MC Agar MacConkey

MRS Agar/caldo Man, Rogosa y Sharpe

TS Tripticasa de soja

CC Caldo cerebro corazón

LPS Lipopolisacárido

SH2 Sulfuro de hidrógeno

UFC Unidades formadoras de colonias

PCR Reacción en cadena de la polimerasa (polymerase chain reaction)

ELISA Enzimoinmunoensayo (enzyme-linked immunosorbent assay)

c.s.p. Cantidad suficiente para

S. Salmonella

L. Lactobacillus

Gallus gallus domesticus Gallina doméstica

VIII

FIGURAS

Figura II.1. Ilustración del tracto gastrointestinal de Gallus gallus domesticus. 4

Figura II.2. Ilustración de cortes de varias porciones del tracto gastrointestinal de las

aves. 9

Figura II.3. Ilustración de la mucosa intestinal. 13

Figura II.4. Microfotografías de la pared duodenal de pollito de 12 días de vida,

mostrando sus distintas estructuras. 14

Figura II.5. Microfotografía de la mucosa duodenal de pollito. 17

Figura II.6. Microfotografía de vellosidades intestinales de pollito. 18

Figura II.7. Microfotografía electrónica del citoplasma apical de enterocitos. 18

Figura II.8. Microfotografías de las túnicas que componen la pared intestinal de pollito.

20

Figura II.9. Modelo de interacciones entre la microbiota intestinal, el huésped, la dieta

y la microbiota de la cama. 23

Figura II.10. Diagrama de flujo de la selección de probiótico en la industria avícola. 30

Figura II.11. Representación esquemática del concepto de probióticos. 32

Figura II.12. Ilustración de los posibles efectos de bacterias probióticas. 35

Figura II.13. Microfotografías de dos cepas de Salmonella Typhimurium captadas por

microscopía electrónica. 40

Figura II.14. Esquema del modo de transmisión de salmonelosis en humano. 42

Figura II.15. Serosa duodenal de pollito de 14 días de vida infectado con Salmonella

Enteritidis al 1° día de vida. 49

Figura III.1. Recuento bacteriano mediante el método de microgotas sobre agar según

Miles et al. (1938). 57

IX

Figura III.2. Secuencia de pasos del procesado histológico de rutina. 60

Figura III.3. Fotografías del cortado de una muestra de duodeno incluida en parafina.61

Figura III.4. Cortes histológicos de duodeno de pollitos en estudio. 62

Figura IV.1. Microfotografías de mucosa duodenal de pollitos de 12 días de vida

mostrando lesiones microscópicas. 74

GRÁFICOS

Gráfico II.1. Cantidad de publicaciones científicas sobre microbiota normal, prebióticos

y probióticos desde 1960 a 2010. 26

Gráfico IV.1. Altura de vellosidades por grupo. 67

Gráfico IV.2. Profundidad de criptas de Lieberkühn por grupo. 69

Gráfico IV.3. Resultados de la evaluación cualitativa de la integridad de mucosa

duodenal. 72

Gráfico IV.4. Resultados de la evaluación cualitativa del infiltrado linfocitario de

mucosa duodenal. 73

Gráfico IV.5. Resultados del análisis bacteriológico de muestras de hígado y bazo. 77

TABLAS

Tabla II.1. Resumen de efectos de diferentes especies de Lactobacillus. 37

Tabla II.2. Caracterización bioquímica de cinco especies de Salmonella. 41

Tabla III.1. Esquema de inoculación con Lactobacillus reuteri cepa MCY. 55

Tabla IV.1. Recuento bacteriano de los inóculos de Lactobacillus reuteri. 65

Tabla IV.2. Conjunto de datos sobre altura de vellosidades duodenales analizados. 66

X

Tabla IV.3. Resultados del test de ANOVA para altura de vellosidades. 67

Tabla IV.4. Conjunto de datos sobre profundidad de criptas de Lieberkühn analizados.

68

Tabla IV.5. Resultados del test de ANOVA para profundidad de criptas de Lieberkühn. 69

Tabla IV.6. Resultados del test de comparaciones múltiples de Tukey para profundidad

de criptas de Lieberkühn. 70

Tabla IV.7. Razón de las medidas histomorfométricas de vellosidades y criptas de

Lieberkühn. 71

Tabla IV.8. Integridad de la mucosa duodenal. 71

Tabla IV.9. Infiltrado linfocitario en mucosa duodenal. 72

Tabla IV.10. Resultados de las pruebas bioquímicas realizadas a partir de colonias

provenientes del cultivo de meconio. 75

Tabla IV.11. Resultados del análisis bacteriológico de muestras de órganos. 76

XI

Learning is experience. Everything else is just information.

―Albert Einstein

1

I. INTRODUCCIÓN

Argentina ocupa el octavo lugar en producción de carne avícola y sexto en exportación

a nivel mundial. Esto denota la importancia de la industria avícola para el país. El Plan

Estratégico Industrial 2020 proyectaba alcanzar una producción de 3 millones de

toneladas y un consumo interno de 50 kg per cápita. En el período 2010-2015, la

producción de carne aviar creció a una tasa anual acumulada de 4,3%, logrando 1,97

millones de toneladas, impulsada por el crecimiento del consumo interno y de las

exportaciones, siendo la industria cárnica con el comportamiento más dinámico de los

últimos años. Entre 2003 y 2015, el consumo interno de carne aviar se duplicó,

instalándose como la segunda carne más consumida con el 38% del consumo cárnico

per capita (Ministerio de Industria, 2012; Ministerio de Hacienda y Finanzas Públicas,

2016).

La carne aviar argentina cuenta con una buena inserción en los mercados

internacionales, siendo los principales destinos China (23%), Chile (11%), Arabia

Saudita (7%) y Emiratos Árabes (7%), que concentran casi la mitad de las

exportaciones. También ocurre algo similar con los subproductos derivados de la

faena. En el periodo 2010-2015, en promedio, 16% de la producción cárnica aviar se

destinó al mercado externo. Así, se proyectan buenas perspectivas en exportaciones,

con el objetivo de consolidar nuevos destinos de exportación. Uno de los desafíos para

lograr una aún mejor inserción en el mercado internacional, es la mejora de la sanidad.

A pesar de un buen estándar sanitario general, mejores y mayores controles sanitarios

favorecerían la demanda de mercados externos (Ministerio de Hacienda y Finanzas

Públicas, 2016).

La aparición de resistencia bacteriana a los antibióticos, en particular aquellos

utilizados como promotores de crecimiento, llevó a la prohibición del uso de estos

fármacos con objetivos que no fueran de terapéuticos, lo cual promovió la búsqueda

de alternativas (Apajalahti, Kettunen y Graham, 2004; Marie y Smith, 2014; Blajman

et al., 2015; Pedroso y Lee, 2015; Kogut y Arsenault, 2016). Entre estas, se destacan los

probióticos, microorganismos vivos con características particulares, que administrados

en cantidades adecuadas generan beneficio tanto sanitarios como productivos

2

(FAO/OMS, 2006). Estos se vuelven una alternativa prometedora para reemplazar a los

antibióticos promotores del crecimiento en los sistemas de producción intensivos. En

la producción de pollos parrilleros, los probióticos son utilizados para mejorar la

sanidad y la producción, obteniendo materias primas de mejor calidad e inocuas

(Blajman et al., 2015). Los probióticos más utilizados se conforman de bacterias ácido-

lácticas, como Lactobacillus y Bifidobacterium (Blok et al., 2002; Dunislawska et al.,

2017). Estos microorganismos probióticos pueden ser una vía efectiva en la reducción

de prevalencia y severidad de enfermedades (Pedroso y Lee, 2015).

OBJETIVOS

Teniendo en cuenta la extensa información sobre la utilización de probióticos y sus

efectos, los objetivos de la presente tesina son:

1. Describir comparativamente la histomorfometría y las lesiones histopatológicas

en duodeno de pollitos infectados naturalmente con Salmonella spp. bajo

tratamiento probiótico con Lactobacillus reuteri cepa MCY.

2. Evaluar la capacidad protectora del probiótico de Lactobacillus reuteri cepa

MCY frente a una infección natural de Salmonella spp.

3

II. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

ANATOMÍA DEL SISTEMA DIGESTIVO DE LAS AVES

Para que las aves sobrevivan y tengan buen desempeño productivo, es necesario que

el tracto digestivo presente las características estructurales y funcionales que le

permitan la adecuada obtención de energía y nutrientes (Romer y Parsons, 1981;

Pelicano et al., 2003). La anatomía de este sistema determina el tipo de alimentos que

puede ingerirse y digerirse. Por consiguiente, cualquier alteración digestiva

compromete la performance del ave (Turk, 1982).

Debido a las particularidades que lo diferencian de otros animales, el tracto digestivo

de las aves ha sido ampliamente estudiado (Zietschmann, 1911; Calhoun, 1954;

Bradley y Grahame, 1960; Hodges, 1974; King, Anthony Stuart McLelland, 1975; Hill,

1976; Turk, 1982). Entre dichas características diferenciales, la más importante y

distintiva es la presencia de un pico de queratina. Debido a la ausencia de paladar

blando, la cavidad oral y la faríngea no se encuentran separadas, por lo que forman

una sola cavidad denominada orofaringe. Esta incluye el pico, la lengua, un paladar

duro largo, papilas cornificadas —dispuestas en hileras entre el cuerpo y la raíz

lingual— y la faringe. Hacia caudal, le siguen el esófago, con una dilatación especial —

llamada buche—, dos estómagos —proventrículo o estómago glandular, y ventrículo,

molleja o estómago muscular—, completando con el intestino delgado, dos ciegos,

colon y cloaca. A su vez, cuenta con glándulas anexas, que incluyen a las glándulas

salivares, hígado y páncreas, y tejidos linfoides asociados, como en el divertículo de

Meckel, las tonsilas cecales y la bolsa de Fabricio; ver Figura II.1 (Turk, 1982; Boleli,

Maiorka y Macari, 2002; Claver, 2014; Zanuzzi y Barbeito, 2014; Scanes, 2015).

Las aves en general presentan variaciones en sus sistemas digestivos, debido a

adaptaciones morfológicas y funcionales, principalmente inducidas por la

alimentación. Incluso entre las especies de producción se observan diferencias, por

ejemplo, en los estómagos o intestino grueso (Frappier, 2006). Y como la evolución de

las aves requirió adaptar el cuerpo al vuelo, el sistema digestivo presenta diferencias

con otros grupos de animales. Esto llevó a la ausencia de dientes y grandes masas

4

musculares mandibulares, reemplazados por el pico, una menor longitud y menor peso

del sistema digestivo en comparación con mamíferos (T.G.Browne, 1922; Claver, 2014;

Scanes, 2015). Las aves tienen menor área de digestión y absorción, menor tiempo de

retención del contenido y menor eficiencia en la captura de nutrientes (Turk, 1982).

Figura II.1. Ilustración del tracto gastrointestinal de Gallus gallus domesticus. A.

Pico; B. lengua; C. faringe; D. esófago; E. buche; F. proventrículo; G. ventrículo o

molleja; H. hígado; I. vesícula biliar; J. páncreas; K. duodeno; L. yeyuno; M.

divertículo de Meckel; N. íleon; Ñ. ciegos; O. tonsilas cecales; P. colon; Q. cloaca;

R. bolsa de Fabricio.

5

La función principal de este sistema es la digestión de los alimentos y la posterior

absorción de las partículas resultantes, las cuales a través del torrente sanguíneo se

distribuyen por todo el organismo (Frappier, 2006; Scanes, 2015). Sin embargo, sus

funciones también se extienden a la protección del individuo, ya que es la mayor

barrera inmunológica contra los agentes patógenos externos que pudieran ingresar a

través de la vía oral (Scanes, 2015). Entre las características del sistema digestivo, las

secreciones intestinales representan una gran ventaja, ya que en su composición

cuenta con mucina —protectora y lubricante—, agua, enzimas, inmunoglobulinas y

otros elementos necesarios para la digestión de los alimentos y la protección del

organismo (Zanuzzi y Barbeito, 2014).

EL INTESTINO DE LAS AVES

Pilz (1937) y Grau (1943) describieron el intestino de las aves considerándolo

conformado por tres partes: intestino delgado, ciegos e intestino grueso (Boleli,

Maiorka y Macari, 2002; Frappier, 2006; Claver, 2014). El intestino queda comprendido

en el saco peritoneal ventral, ocupa la parte caudal de la cavidad corporal y establece

relación con la molleja y los órganos reproductores. A pesar de la presencia de un asa

duodenal, generalmente se considera al divertículo de Meckel —un remanente ciego

del saco vitelino— como la separación entre yeyuno e íleon (Jacob, Pescatore y Cantor,

2011; Scanes, 2015).

Intestino Delgado

Se divide a este órgano en tres porciones, denominadas duodeno, yeyuno e íleon, a

pesar de la dificultad para delimitarlas (Boleli, Maiorka y Macari, 2002; Jacob,

Pescatore y Cantor, 2011; Claver, 2014; Zanuzzi y Barbeito, 2014). Su fisiología e

histología son similares a las encontradas en mamíferos, pero presentan algunas

diferencias. En las aves, las vellosidades intestinales son más largas, lo que permite una

mayor superficie para la digestión y absorción, las criptas intestinales —o criptas de

6

Lieberkühn— son más cortas en comparación, y el duodeno carece de glándulas de

Brünner (Claver, 2014).

La primera porción, el duodeno, se encuentra hacia caudal del ventrículo. Es

fácilmente identificable por presentar una sola asa, con una porción proximal

descendente y otra distal ascendente, dándole forma de "U" a este segmento del

intestino delgado; entre las porciones del asa duodenal, se encuentra el páncreas. A

continuación, se encuentra el yeyuno, la porción más larga del intestino delgado,

conformando varias asas intestinales. El divertículo de Meckel es la referencia para la

división del yeyuno con el íleon, ya que estas dos porciones no se encuentran

demarcadas (Boleli, Maiorka y Macari, 2002; Zanuzzi y Barbeito, 2014). A partir de allí,

el íleon continúa su trayecto hasta la unión ileo-cólica, donde desembocan los dos

ciegos y comienza el intestino grueso (Zanuzzi y Barbeito, 2014).

El intestino delgado es la porción más larga del tracto gastrointestinal, responsable de

la digestión final y la absorción de los nutrientes (Turk, 1982; Boleli, Maiorka y Macari,

2002), teniendo una gran extensión de su superficie destinada a estas funciones

(Zanuzzi y Barbeito, 2014). La mayor parte de la digestión del alimento ocurre en el

lumen intestinal, tanto por enzimas pancreáticas e intestinales como por la bilis

secretada por el hígado (Turk, 1982). Por su parte, el borde apical de las células

intestinales contiene otras enzimas, como la sucrosa-isomaltasa, peptidasa y

fosfatasas, responsables de la digestión de almidón, sucrosa, grasas y proteínas. En el

yeyuno se desarrolla la mayor actividad enzimática, siendo menor tanto hacia proximal

como caudal del intestino. En cuanto a la absorción, la capacidad de la misma aumenta

en relación con el peso corporal del individuo (Scanes, 2015).

Intestino Grueso

El intestino grueso de las aves comprende los ciegos, el colon y la cloaca. La inclusión

de los ciegos dentro del intestino grueso presenta cierta controversia, ya que algunos

autores los incluyen (e.g. Scanes, 2015), mientras otros los indican por separado del

intestino grueso (e.g. Turk, 1982). Por cuestiones prácticas, en la presente tesina se

7

tendrá en cuenta a los ciegos como órganos conformantes del intestino grueso,

asumiendo el criterio utilizado en otras especies de animales domésticos estudiadas.

Los ciegos son estructuras saculares pares que se disponen en proximal y

paralelamente al íleon, desembocando en la unión ileo-cólica (Frappier, 2006),

demarcando el límite entre intestino delgado y grueso (Claver, 2014). A mitad de su

longitud, estos órganos se doblan sobre sí mismos (Turk, 1982).

Por sus características morfológicas, se los divide en tres regiones: la región basal o

distal o basis ceci, la región media o corpus ceci, y la región apical o proximal o apex

ceci. En los adultos, se forman masas de tejido linfoide difuso y nodular en la primera

porción de los ciegos, formando las tonsilas cecales, que representan un importante

sitio de respuesta inmunitaria (Turk, 1982; Frappier, 2006; Zanuzzi y Barbeito, 2014;

Scanes, 2015).

En las diferentes especies de aves existen diversos tipos de ciegos que se agrupan

según su morfo-fisiología en:

1. Tipo Primitivo o Intestinal: semejantes al intestino, con función meramente

digestiva. Dentro de las aves de producción, se puede ver este tipo de ciegos en

patos y gansos.

2. Tipo Glandular o Engrosado: Caracterizados por su gran desarrollo, son largos,

tienen función en digestión y absorción; presentan secreción profusa por la

gran cantidad de criptas activas. Sus características responden a una

adaptación a mayores concentraciones de celulosa en la dieta, y presentan

microbiota que permite un uso más eficiente de los carbohidratos. Este es el

tipo que observamos en gallinas.

3. Tipo Linfoepitelial: Su función principal es inmunológica, con una reducida

función digestiva.

4. Tipo Vestigial: de escaso desarrollo e incorporados en la pared intestinal.

Así, se observa una gran adaptación de los ciegos a las condiciones ecológicas de las

diferentes especies de aves. En aves de producción se observa una adaptación tal que

8

se llegó a una eficiencia de fermentación muy elevada, incluso mayor a algunos

mamíferos herbívoros (Zanuzzi y Barbeito, 2014).

En estos órganos se produce digestión de la fibra vegetal gracias a la ayuda de

actividad microbiana, reabsorción del agua remanente en el contenido intestinal y la

reabsorción de la orina que llega a los ciegos por flujo retrógrado. También se

sintetizan y absorben ocho vitaminas del grupo B (tiamina, riboflavina, niacina, ácido

panteténico, piridoxina, biotina, ácido fólico y vitamina B12) y numerosos ácidos

grasos (Turk, 1982; Claver, 2014). Chaplin (1989) demostró que la cecotomía producía

una menor metabolización del alimento, con mayor pérdida de aminoácidos y menos

digestibilidad de la fibra cruda.

El colon es corto, rectilíneo, con vellosidades, y se extiende desde la unión ileo-cólica

hasta la cloaca, aproximadamente 5-8 cm (Turk, 1982; Boleli, Maiorka y Macari, 2002;

Frappier, 2006; Jacob, Pescatore y Cantor, 2011). Presenta pliegues, más apreciables

cuando está vacío, que desaparecen cuando se distiende (Turk, 1982).

La cloaca es una estructura dilatada, en forma de bolsa, en la pared de la cual

desembocan el colon, los uréteres y ductos del sistema reproductivo (Scanes, 2015).

Así, en la cloaca se mezclan los desechos urinarios (uratos) y los digestivos, por lo que

la materia fecal resulta en desechos digestivos con cristales de ácido úrico en la

superficie. La consistencia y color de las defecaciones son indicativos de la salud de las

gallinas (Jacob, Pescatore y Cantor, 2011).

Tanto el colon como la cloaca cumplen funciones en la reabsorción de agua y

electrolitos (Jacob, Pescatore y Cantor, 2011; Scanes, 2015).

Dorsalmente a la cloaca, se encuentra la bolsa de Fabricio, un órgano linfoepitelial

exclusivo de las aves, con importante función inmunológica, ya que sirve de sitio para

la maduración y diferenciación de los linfocitos B (Tizard, 1995; Scanes, 2015). También

en dorsal a la cloaca se encuentra la glándula proctodeal dorsal, que secreta un fluido

blanco espumoso, de importancia en la reproducción (Scanes, 2015).

9

HISTOLOGÍA DUODENAL

A lo largo del Siglo XX se han realizado descripciones histológicas del tracto digestivo

de las aves de corral (Calhoun, 1954; Aitken, 1958; Farner, 1960; Humphrey y Turk,

1974). Si bien existen diferencias puntuales entre los estudios, ya sea por diferencias

metodológicas o interpretaciones variables de los resultados, todos concuerdan en la

estructura histológica básica de este tracto.

El duodeno de las aves, al igual que el resto del tracto digestivo, presenta una

estructura histológica similar a la de los mamíferos, siendo un tubo multicapa con:

túnica mucosa, túnica submucosa, túnica muscular y túnica serosa (Turk, 1982;

Frappier, 2006; Zanuzzi y Barbeito, 2014; Scanes, 2015).

Figura II.2. Ilustración de cortes de varias porciones del tracto gastrointestinal de

las aves. A. Esófago con glándulas submucosas; B. Esófago sin glándulas

submucosas; C. Duodeno; D. Intestino grueso. Túnica mucosa: epitelio (E), lámina

propia (F), muscular de la mucosa (G); túnica submucosa (H); túnica muscular

circular (I) y longitudinal (J); túnica serosa (K); túnica adventicia (L) (Frappier,

2006).

10

La superficie luminal del duodeno de los animales en general presenta una estructura

definida cuyo objetivo es aumentar la superficie de absorción. Así, se presentan tres

grados de amplificación que incluyen microvellosidades, vellosidades, y pliegues de la

mucosa y submucosa, según la especie. En gallinas (Gallus gallus domesticus) no se

observan pliegues macroscópicos, delegando el aumento de la superficie a las

vellosidades y microvellosidades (Turk, 1982; Boleli, Maiorka y Macari, 2002; Frappier,

2006; Zanuzzi y Barbeito, 2014). Se observan vellosidades de diversa longitud según el

segmento, disminuyendo progresivamente hacia caudal. Durante los primeros días de

vida ocurre una disminución en el número de vellosidades, para luego permanecer

constante (Scanes, 2015).

TÚNICA MUCOSA

La túnica mucosa está formada por el epitelio, la lámina propia y la muscular de la

mucosa, estando estas últimas dos capas poco desarrolladas en las aves (Boleli,

Maiorka y Macari, 2002) Figura II.3 y Figura II.4.

El desarrollo de la mucosa se debe a dos eventos citológicos primarios asociados: la

renovación celular, que involucra la proliferación y diferenciación de las células,

resultado de mitosis de células totipotentes en las criptas de Lieberkühn y, a diferencia

de mamíferos, a lo largo de las vellosidades (Uni, Ganot y Sklan, 1998); y la muerte

celular con descamación en el ápice de las vellosidades. El equilibrio entre ambos

procesos citológicos determina la tasa de renovación —o turnover—, lo cual influye

sobre la capacidad digestiva y absortiva del órgano (Imondi y Bird, 1966; Boleli,

Maiorka y Macari, 2002; Pelicano et al., 2003).

Las vellosidades son evaginaciones de la túnica mucosa y están presentes a lo largo de

todo el intestino delgado y grueso, incluso en ciegos. Estas estructuras tienen forma

elipsoidal, a diferencia de los mamíferos donde son digitiformes (Bayer et al., 1975;

Michael y Hodges, 1975; Witlock et al., 1975; Turk, 1982), con una disposición en

zigzag, y varían en número y dimensiones a lo largo del intestino. Por ejemplo, sus

dimensiones varían de 1,5 mm en duodeno a 0,4-0,6 mm en el íleon y colon, y su

11

cantidad disminuye dentro de los primeros 10 días de vida, para mantenerse constante

de ahí en más (Yamauchi e Isshiki, 1991; Frappier, 2006; Bacha y Bacha, 2012; Zanuzzi y

Barbeito, 2014; Scanes, 2015). Esta reducción de la densidad de vellosidades luego de

los 10 días post-eclosión no implica una reducción en la capacidad absortiva, sino un

mayor desarrollo de las vellosidades, existiendo un efecto contrario. La capacidad

digestiva y absortiva está determinada proporcionalmente por la densidad de

vellosidades y el tamaño de estas, o sea, la superficie disponible para la absorción

(Macari, 1995; Boleli, Maiorka y Macari, 2002). La morfología y densidad de

vellosidades y criptas varían con la dieta (Humphrey y Turk, 1974; Yamauchi e Isshiki,

1991; Zanuzzi y Barbeito, 2014) y los estímulos patógenos (Fernando y McCraw, 1973).

Incluso, existen diferencias morfológicas de las vellosidades entre líneas genéticas de

gallinas ponedores y pollos parrilleros, debido a la selección genética (Yamauchi e

Isshiki, 1991; Boleli, Maiorka y Macari, 2002). Si bien presentan el mismo modelo de

desarrollo de parámetros morfométricos, estas líneas difieren en la tasa de desarrollo

(Boleli, Maiorka y Macari, 2002). Los pollos parrilleros tienen vellosidades de mayor

tamaño, con menor densidad, y muestran más protrusiones de células epiteliales en el

ápice que las gallinas ponedoras de la línea White Leghorns. A pesar de las diferencias,

ambas genéticas comparten una disposición de las vellosidades en zigzag, lo cual

podría contribuir a enlentecer el flujo de la ingesta (Scanes, 2015) y brindar una

estructura de absorción más eficiente que una organización paralela o aleatoria de las

vellosidades (Yamauchi e Isshiki, 1991).

Las vellosidades presentan una superficie lisa, con algunos pliegues o grietas. En

duodeno, son más altas, anchas y con ápice más redondeado que en el yeyuno

(Witlock y Ruff, 1977). Humphrey y Turk (1974) indican que es común encontrar

vellosidades ramificadas a lo largo del tracto intestinal. En su ápice, se produce la

descamación de las células muertas (Turk, 1982). En pollos parrilleros se puede

observar una descamación más frecuente, lo cual podría indicar una renovación celular

activa atribuible a la actividad nutricional aumentada del intestino (Yamauchi e Isshiki,

1991).

12

Como en el duodeno las vellosidades son más largas y las criptas más profundas que

las demás porciones del intestino, la mucosa de este sector resulta de mayor grosor

(Zanuzzi y Barbeito, 2014).

El epitelio de revestimiento de las vellosidades duodenales es de tipo simple cilíndrico

absortivo, siendo una barrera permeable para nutrientes y la primera línea de defensa

contra patógenos (Christ y Blumberg, 1997; Strober, 1998). De su estructura

histológica dependerá su adecuada función y la óptima performance productiva

(Nicoletti et al., 2010). Estas células epiteliales, denominadas enterocitos, presentan

una altura de 20-25 µm y un ancho de 7-8 µm, con un núcleo alargado situado en los

dos tercios inferiores del citoplasma, y se caracterizan por su borde apical con miles de

microvellosidades, también llamado borde en cepillo. Entre los enterocitos se mezclan

células caliciformes —o de Goblet— a lo largo de toda la vellosidad, y células

enteroendócrinas hacia la base. A su vez, se pueden observar linfocitos

intraepiteliales; Figura II.4 (Aitken, 1958; Humphrey y Turk, 1974; Turk, 1982; Boleli,

Maiorka y Macari, 2002; Frappier, 2006; Welsch y Sobotta, 2008; Zanuzzi y Barbeito,

2014; Scanes, 2015). Tanto los enterocitos como las células caliciformes y las

enteroendócrinas se desarrollan a partir del mismo tipo de célula totipotente (Gordon,

1993).

Los enterocitos son células típicamente cilíndricas altas, pero se encuentran bajos

hacia la base de las criptas. Estas células se encargan de la digestión final de los

alimentos, y el transporte transepitelial de los nutrientes desde y hacia el lumen. En la

superficie apical, las microvellosidades, con una altura de 1000 nm y ancho de 10 nm

(Humphrey y Turk, 1974), aumentan la superficie de contacto, digestión, absorción y

secreción (Boleli, Maiorka y Macari, 2002; Zanuzzi y Barbeito, 2014). Estas presentan

enzimas disacaridasas en la superficie luminal, importantes en la digestión de la

ingesta (Siddons, 1969; Enigk y Dey-Hazra, 1976; Turk, 1982). Además, los enterocitos

contienen gran cantidad de mitocondrias —en especial en la parte basal—, retículo

endoplásmico, ribosomas, túbulos y lisosomas (Turk, 1982).

13

Figura II.3. Ilustración de la mucosa intestinal. Se pueden observar los diferentes

tipos celulares que se encuentran en la mucosa duodenal.

Dispersas entre los enterocitos, se encuentran las células caliciformes, las cuales

cumplen funciones de secreción de glicoproteínas protectoras del epitelio intestinal.

Presentan una morfología característica similar a un cáliz por la acumulación de

vesículas de mucinógenos en la región apical, mientras que el núcleo y el citoplasma

son empujados hacia la base angosta. Su secreción forma una capa que cubre las

vellosidades, protegiendo a la mucosa de la acción de las enzimas digestivas y los

efectos abrasivos de la ingesta, tanto durante el desarrollo in ovo como post-eclosión.

La capa de mucus podría colaborar en la absorción a través de proteínas de unión al

calcio. Estas células se encuentran en menor número hacia el ápice de las vellosidades

y, en cuanto a los órganos, aumenta su cantidad hacia caudal, siendo el colon el de

mayor concentración (Turk, 1982; Boleli, Maiorka y Macari, 2002; Frappier, 2006).

14

Figura II.4. Microfotografías de la pared duodenal de pollito de 12 días de vida,

mostrando sus distintas estructuras. | Izquierda- En esta imagen, se aprecian las

vellosidades, las criptas de Lieberkühn y las distintas túnicas histológicas. A.

Túnica mucosa; B. Túnica submucosa; C. Túnica muscular; D. Serosa. En túnica

mucosa: epitelio (E), lámina propia (F), lámina muscular de la mucosa (G),

vellosidad (V), cripta de Lieberkühn (GL). En submucosa y serosa: Arteria (H), Vena

(I). Tinción hematoxilina-eosina. Aumento 10x. | Derecha arriba- En esta imagen,

a un aumento de 40x, se pueden apreciar las distintas láminas y túnicas. Tinción

hematoxilina-eosina. | Derecha centro y abajo- Con un aumento de 100x es

posible apreciar la estructura histológica de las criptas de Lieberkühn en detalle.

Se pueden identificar fácilmente células caliciformes (*) y linfocitos (→). Tinción

hematoxilina-eosina.

15

Entre las bases de las vellosidades, se abren las glándulas intestinales o criptas de

Lieberkühn. Estas son glándulas simples tubulares, cortas y ligeramente sinuosas, que

penetran la mucosa hasta la lámina muscular. Presentan varios tipos celulares, siendo

el principal las células columnares indiferenciadas, o troncales, hacia la base. Son

células de rápida división que se multiplicarán y diferenciarán en enterocitos o células

caliciformes, para luego migrar hacia el ápice de la vellosidad, donde a las 48-96 horas

se descamarán hacia el lumen (Imondi y Bird, 1966). Por esta gran renovación celular,

es posible observar diversas figuras mitóticas en las células de las glándulas (Turk,

1982; Frappier, 2006; Zanuzzi y Barbeito, 2014). En las glándulas intestinales, también

se encuentran células enteroendócrinas, caliciformes y linfocitos (Frappier, 2006;

Scanes, 2015).

Las células enteroendócrinas —cromafines o argentafines— son células piramidales,

ubicadas intercaladamente entre los enterocitos, con gránulos marcadamente

eosinofílicos, más numerosas hacia la base de las criptas, y que se extienden hasta la

base de las vellosidades (Buffa et al., 1978; Sternini, Anselmi y Rozengurt, 2008;

Gunawardene, Corfe y Staton, 2011). Disminuyen en número desde el duodeno hacia

el recto (Aitken, 1958; Zanuzzi y Barbeito, 2014). Son productoras de hormonas

peptídicas (e.g. gastrina, colecistoquinina, secretina, polipéptido inhibidor gástrico) y

monoaminas biógenas que participan en la regulación de la digestión, absorción y

utilización de los nutrientes (Solcia et al., 1979; Boleli, Maiorka y Macari, 2002;

Sternini, Anselmi y Rozengurt, 2008; Zanuzzi y Barbeito, 2014)

La presencia de células de Paneth en aves es un tema en discusión, ya que algunos

autores las mencionan y otros no las identificaron. Así, se citan en aves del género

Anas y algunas paseriformes. En el caso de Gallus gallus domesticus, Scanes (2015)

sostiene que estas células se ubican hacia la base de las criptas, coincidiendo con

Bradley y Grahame (1960) y Humphrey y Turk (1974). Bradley y Grahame (1960)

sostuvieron la presencia de estas células en todo el trayecto del intestino; incluso en

estudios anteriores se daba cuenta de estas células (von Greschick, 1922; Clara, 1926).

Sin embargo, con anterioridad, Cloetta (1893) ya dudaba de la presencia de células de

Paneth en el intestino de gallinas, y autores como Aitken (1958), Hodges (1974) y Boleli

et al. (2002) lo afirman en sus estudios, donde no encontraron dicho tipo celular. Se

16

sugiere que estas diferencias corresponden a un error en el análisis de los tipos

celulares, confundiendo células enteroendócrinas con células de Paneth, ya que se

presentan muy eosinofílicas y son fácilmente observables (Aitken, 1958).

Por debajo del epitelio, se encuentra la lámina propia, conformada por tejido

conectivo laxo con un entramado de fibras reticulares, que se extiende por el espacio

interglandular y el eje de las vellosidades. Dentro del entramado reticular se localizan

vasos sanguíneos, nervios, leucocitos, fibrocitos, células musculares lisas, células

plasmáticas, y células cebadas o mastocitos. Encontramos tejido linfático difuso y

nodular a lo largo de todo el intestino, pudiendo incrementarse con la edad del ave. En

aves adultas, también se encuentran fibras elásticas (Frappier, 2006; Zanuzzi y

Barbeito, 2014).

La irrigación sanguínea está dada por una arteriola proveniente del plexo en la

submucosa, la cual atraviesa la muscular de la mucosa y se dirige hacia el ápice de la

vellosidad. Allí se forma una red capilar por debajo de los enterocitos, quedando el

lumen y la sangre separados sólo por una capa celular. A diferencia de los mamíferos,

en las aves no se observa vaso quilífero o lacteal en el centro de las vellosidades

(Humphrey y Turk, 1974; Turk, 1982; Frappier, 2006; Zanuzzi y Barbeito, 2014). Es

probable que en las aves, el sistema portal sea la vía de absorción de lípidos más

importante (Noyan et al., 1964; Humphrey y Turk, 1974).

La lámina muscular de la mucosa —lamina muscularis—, en el caso de las aves, sólo se

compone de una capa de fibras musculares lisas longitudinales, a diferencia de los

mamíferos que cuentan con una segunda capa circular. Hacia caudal, cerca de la unión

ileo-cólica, la muscular de la mucosa se engrosa, e incluso en ciego se observan dos

capas de fibras musculares lisas (Frappier, 2006; Zanuzzi y Barbeito, 2014).

17

Figura II.5. Microfotografía de la mucosa duodenal de pollito, magnificación 114x.

V. Vellosidad; GL. Criptas de Lieberkühn; L. lumen intestinal (Humphrey y Turk,

1974).

18

Figura II.6. Superior- Microfotografía

de vellosidades intestinales de pollito,

magnificación 682x. P. Enterocitos;

GC. células de Goblet; L. leucocitos

globulares | Inferior- Microfotografía

de criptas de Lieberkühn,

magnificación 586. GL. Criptas de

Lieberkühn: células de Paneth* (PC),

células granulares basales (A). |

Recuadro a 1165x (Humphrey y Turk,

1974). *Según los autores, se observan

PC en las aves de corral.

Figura II.7. Superior- Microfotografía

electrónica del citoplasma apical de

enterocitos, magnificación 25480x.

MV. Microvellosidades; GX. glucocálix;

PM. membrana plasmática; PV.

vesículas pinocíticas. Se observa una

unión estrecha (TJ) en el borde apical

de la célula, y desmosomas (D) en la

membrana celular (CM). | Recuadro a

76000x; puntas de microvellosidades

cubiertas de glucocálix (G); F.

filamentos; PM. membrana plasmática

trilaminar. | Inferior- Microfotografía

electrónica de citoplasma apical de

enterocito, magnificación 15900x. V.

vesículas; MT. microtúbulos; M.

mitocondria. | Recuadro a 47490x; mitocondria con gránulos densos (Humphrey y Turk,

1974).

19

TÚNICA SUBMUCOSA

La túnica submucosa es una estructura delgada conformada por tejido conectivo

denso, con fibras colágenas y elásticas. En esta túnica se pueden encontrar grandes

cantidades de tejido linfoide en forma difusa o en nódulos. También, se encuentran

vasos sanguíneos ramificaciones de la arteria celíaca, tanto de su rama derecha como

izquierda (Kuru, 2010; Rezk y El-Bably, 2014), y el plexo nervioso submucoso, cuyas

ramificaciones se extienden en las vellosidades. En ocasiones, la submucosa se

presenta demasiado delgada y sólo es posible observar plexo nervioso; incluso se

dificulta la diferenciación entre la capa muscular de la mucosa y la túnica muscular

(Frappier, 2006; Bacha y Bacha, 2012; Zanuzzi y Barbeito, 2014).

Una característica del intestino de las aves es no tener glándulas submucosas —o de

Brünner—, a diferencia de lo que se puede observar en mamíferos (Calhoun, 1954;

Aitken, 1958; Boleli, Maiorka y Macari, 2002; Frappier, 2006; Claver, 2014; Zanuzzi y

Barbeito, 2014). Posiblemente, la abundancia de células secretoras de mucus en la

superficie del epitelio y porción apical de las glándulas en la zona de transición entre

ventrículo e intestino compense la ausencia de las glándulas submucosas y de una

estructura de función análoga al píloro de mamíferos (Aitken, 1958).

TÚNICA MUSCULAR

Al igual que otras especies, la túnica muscular del intestino delgado de las aves

consiste de una capa interna de músculo liso circular y una capa externa de músculo

liso dispuesto longitudinalmente, siendo esta última más delgada. Entre estas dos

capas, se encuentra tejido conjuntivo, donde se alojan los vasos sanguíneos y el plexo

nervioso mientérico (Frappier, 2006; Zanuzzi y Barbeito, 2014).

TÚNICA SEROSA

El intestino delgado está cubierto en su totalidad por la túnica serosa, la cual está

compuesta por una capa de tejido conectivo laxo, de mayor espesor en la zona de

20

origen del mesenterio, y un mesotelio hacia el exterior (Frappier, 2006; Zanuzzi y

Barbeito, 2014).

Figura II.8. Microfotografías de las túnicas que componen la pared intestinal de

pollito. Arriba- Tinción alcian blue con hematoxilina-eosina. Abajo- Tinción

picrosirius red, la cual tiñe de rojo las fibras de colágeno. Aumento 40x. A. Túnica

mucosa; B. Túnica submucosa; C. Túnica muscular; D. Serosa. Las puntas de flecha

indican vasos sanguíneos.

21

SALUD INTESTINAL Y MICROBIOTA

Actualmente, las avanzadas líneas genéticas de carne presentan un período de

crecimiento mucho más corto, con una eficiencia alimenticia en continua mejora, lo

que lleva a un aumento de peso en un 25% en el primer día y hasta un 5000% para la

quinta semana (Choct, 2009). Debido a estas características de crecimiento, la salud

intestinal —entendida como el equilibrio entre integridad macro y microscópica del

intestino, el estado del sistema inmunitario y el balance de la microbiota que permite

al animal realizar sus funciones fisiológicas para poder soportar factores de estrés

exógenos y endógenos— adquiere una gran importancia en los sistemas productivos,

donde su mantenimiento y mejoramiento es esencial en el bienestar y productividad,

en especial frente a la prohibición del uso de antibióticos (Apajalahti, Kettunen y

Graham, 2004; Choct, 2009; Pedroso y Lee, 2015; Kogut y Arsenault, 2016).

El tracto gastrointestinal de las aves se encuentra colonizado por múltiples especies de

microorganismos que conforman la microbiota, siendo una parte integral del mismo y

creando un ambiente particular dentro del intestino que afecta también la fisiología

del individuo (Apajalahti, Kettunen y Graham, 2004). Incluso, se considera que para

lograr la máxima expresión del potencial genético, el animal debe contar con un

perfecto equilibro en su microbiota (Pedroso y Lee, 2015), ya que la performance del

animal y su eficiencia alimenticia se relacionan con el estado de la microbiota, y

alteraciones en la misma podrían llevar a afecciones en la salud del individuo.

Inicialmente, se creía que los pollitos presentaban un intestino estéril al eclosionar del

huevo (Blok et al., 2002). Sin embargo, Pedroso, Menten y Lambais (2005) y Pedroso

(2009) han demostrado, a través de técnicas moleculares, que el intestino de pollitos

recién eclosionados presenta una microbiota abundante y que existe transmisión

vertical de microorganismos, tanto patógenos como beneficiosos; el embrión sería

colonizado previamente a la formación de la cáscara del huevo, y los microorganismos

se establecerían en el tracto gastrointestinal durante el desarrollo. Por ejemplo, se

sabe de la transmisión de bacterias de los géneros Clostridium, Propionibacterium y

Lactobacillus.

22

Inmediatamente luego de eclosionar, los pollitos entran en contacto con un ambiente

abundante en microorganismos, incluso en incubadoras comerciales, y cuentan con

una microbiota ya estructurada al llegar a la granja (Pedroso, Menten y Lambais,

2005). Sin embargo, al no entrar en contacto con animales adultos, no adquieren la

microbiota de individuos adultos sanos, y el intestino se vuelve un nicho ecológico

endeble donde existe una mayor posibilidad de colonización por parte de

microorganismos patógenos (Crhanova et al., 2011). Esta es una problemática de gran

importancia ante el riesgo de colonización por parte de especies patógenas de

relevancia en salud pública, e.g. Salmonella y Campylobacter.

En el tracto intestinal se pueden identificar 500 especies bacterianas diferentes,

coexistiendo microorganismos transitorios y permanentes, y comensales no

patógenos, oportunistas y patógenos severos (Apajalahti, Kettunen y Graham, 2004;

Lakhan y Kirchgessner, 2010; Pedroso y Lee, 2015). En particular, en el intestino

delgado encontramos una escasa cantidad de microbiota en duodeno, aumentando

cantidad y diversidad hacia distal (Yan y Polk, 2004). Las primeras semanas, el duodeno

se encuentra con una microbiota dominada por Lactobacillus sp., constituyéndose una

microbiota estable recién a las dos o tres semanas (Blok et al., 2002; Wielen et al.,

2002). A lo largo de la vida del animal, el género bacteriano más aislado continúa

siendo Lactobacillus, con una gran cantidad variable de especies.

Durante la vida de las aves de producción, ocurren variaciones en la composición de la

microbiota, tanto temporales relacionadas a la edad, como espacial en relación al

compartimento del tracto intestinal (Pedroso et al., 2012). Incluso, la conformación de

la microbiota intestinal es afectada por la dieta, favoreciendo diferentes bacterias

según su composición, la ingestión de antibióticos, las infecciones por patógenos, el

manejo de la granja y otros factores (Apajalahti, Kettunen y Graham, 2004;

Chaucheyras-Durand y Durand, 2010; Oakley et al., 2014; Mon et al., 2015; Ballou

et al., 2016). Esto es de importancia en el diseño de estrategias que se relacionen a la

microbiota, ya sea para reducir impacto de patógenos como para maximizar la

producción.

23

Figura II.9. Modelo de interacciones entre la microbiota intestinal, el huésped, la

dieta y la microbiota de la cama. Estas interacciones se manifiestan en el

intercambio nutricional, modulación de la morfología, fisiología e inmunidad

intestinal del huésped. Adaptado de Pan y Yu (2014).

Entre los mecanismos de la microbiota que contribuyen a la salud intestinal se

encuentran (Blok et al., 2002; Kogut y Arsenault, 2016):

Mejoramiento de la arquitectura mucosa, favoreciendo la barrera epitelial

intestinal.

Degradación de los sustratos no fermentables hacia compuestos digestibles.

24

Ruptura de sustancias citotóxicas.

Producción de vitaminas.

Supresión de patógenos por:

o Competencia por nutrientes,

o Competencia por sitios de adhesión en mucosa (exclusión competitiva),

o Estimulación de la motilidad intestinal,

o Estimulación del sistema inmunitario,

o Producción de ácidos grasos volátiles,

o Producción de sustancias antimicrobianas.

La microbiota provoca cambios histomorfológicos en la mucosa intestinal, cambiando

no sólo las características de vellosidades y criptas, sino también la densidad de los

vasos sanguíneos y la proliferación de las células madres (Sommer y Bäckhed, 2013). La

asociación entre la población microbiana y la pared intestinal es un importante factor

para el mantenimiento de las bacterias en sitios específicos del tracto (Blok et al.,

2002).

Poblaciones microbianas estables, diversas y sólidas actuarían como reguladoras de la

abundancia de patógenos y su comportamiento, teniendo efecto sobre la resistencia a

la infección y colonización, algo de suma importancia en producción y en especial en

casos de especies patógenas zoonóticas (Blok et al., 2002; Pedroso y Lee, 2015). La

microbiota impide la colonización del intestino por parte de nuevas bacterias a través

del denominado antagonismo bacteriano (Freter, 1956), interferencia bacteriana

(Dubos, 1963), resistencia a la colonización (van der Waaij, Berghuis-de Vries y

Lekkerkerk-van der Wees, 1971) o, más aceptada, exclusión competitiva (Nurmi y

Rantala, 1973; Choct, 2009).

Esta resistencia podría deberse en parte a una mejora en el sistema inmune, ya que la

microbiota afecta el desarrollo y función del sistema inmune de la mucosa a través de

su influencia directa sobre la pared intestinal (Choct, 2009; Malmuthuge, Griebel y

Guan, 2015; Oakley y Kogut, 2016). Una comunidad microbiana estable del animal

desde la primera inoculación lleva al desarrollo del sistema inmune (Apajalahti,

Kettunen y Graham, 2004).

25

Los microorganismos colonizadores tempranos pueden modificar la base de nutrientes

presentes en el medio intestinal, lo que regula la sucesión de especies de la microbiota

durante el desarrollo del pollito (Blok et al., 2002). La utilización de nutrientes,

mejorada por actividad metabólica inter-especie complementaria y la producción de

metabolitos inhibitorios, puede producir una comunidad resistente a la colonización

por patógenos (Pedroso y Lee, 2015).

Existe un rol activo de las células epiteliales en la interacción huésped-

microorganismos a través de sistemas de señalamiento inducido por los receptores de

inmunidad innata. A su vez, el epitelio se cubre de una capa de mucus que forma una

barrera física entre la mucosa y la microbiota (Kogut y Arsenault, 2016).

El mucus superficial del tracto gastrointestinal actúa como lubricante, modula la

absorción de los nutrientes y protege al epitelio contra patógenos entéricos (Blok

et al., 2002; Tsirtsikos et al., 2012). Ya que la composición de este se ve modificada por

reacciones propias del tejido y por la microbiota intestinal (Kirjavainen et al., 1998; Xu

y Gordon, 2003; Ruas-Madiedo et al., 2008), las alteraciones en la microbiota podrían

afectar la dinámica del mucus y la susceptibilidad a patógenos (Corfield et al., 2000;

Byrd y Bresalier, 2004).

La microbiota también contribuye a la actividad enzimática de las vellosidades (Willing

y Van Kessel, 2009); incluso algunas especies de Lactobacillus regulan la expresión de

transportador de glucosa por parte de los enterocitos (Ikari et al., 2002).

26

MICROORGANISMOS PROBIÓTICOS

La preocupación por las enfermedades zoonóticas, en especial aquellas transmitidas

por alimentos, el desarrollo de resistencia a antibióticos, la persistencia de estas

drogas en los alimentos, la demanda de los consumidores por una alimentación más

saludable y las nuevas reglamentaciones sobre el uso de fármacos en las producciones

animales —desde 2006, el Reglamento EC No. 1831/20031 de la Unión Europea

instauró la prohibición del uso de antibióticos promotores de crecimiento en

animales— llevaron a un nuevo enfoque en lo que respecta a la salud de los animales

de producción. Así, se redujo o eliminó el uso de dosis sub-terapéuticas de

antibióticos, como se realizaba con los antibióticos promotores de crecimiento

(Apajalahti, Kettunen y Graham, 2004; Chaucheyras-Durand y Durand, 2010; Blajman

et al., 2015; Pedroso y Lee, 2015). Esto impulsó los estudios de la ecología microbiana

intestinal y las alternativas "naturales" a los tratamientos antibióticos, lo cual

permitiría una mejora en la producción avícola y la salud de los animales (Kabir, 2009;

Chaucheyras-Durand y Durand, 2010; Marie y Smith, 2014; Pedroso y Lee, 2015; Kogut

y Arsenault, 2016).

Gráfico II.1. Cantidad de publicaciones científicas sobre microbiota normal,

prebióticos y probióticos desde 1960 a 2010. Se observa un gran aumento de

artículos científicos relativos a los tres temas durante los últimos 20 años, en

especial aquellos sobre probiótico (Pedroso y Lee, 2015).

27

La prohibición en el uso de los antibióticos promotores de crecimiento, como

contraparte, llevó a un aumento en la incidencia de enfermedades entéricas (Kogut y

Arsenault, 2016). Para hacer frente a estas y superar la vulnerabilidad de colonización

por patógenos, se promovió la utilización de formulaciones de bacterias con actividad

probiótica como productos de exclusión competitiva (Blok et al., 2002; Pedroso y Lee,

2015). La manipulación alimentaria de la microbiota con objeto de aumentar el

número relativo de bacterias beneficiosas contribuiría al bienestar del huésped

(FAO/OMS, 2006). Así, se acortaría el período necesario para establecer una

microbiota estable (Blok et al., 2002) y tendría múltiples acciones beneficiosas para los

animales, incluyendo la prevención de infecciones, la reducción del colesterol, efectos

inmunoestimulantes, mejoras productivas, entre otros (Gomez-Gil et al., 1998;

Pelicano et al., 2003).

Las sustancias bioactivas —i.e. prebióticos, fitobióticos, probióticos y simbióticos—

tienen la capacidad de modular directamente la microbiota intestinal y afectar

indirectamente el organismo del huésped, siendo potenciales alternativas a los

antibióticos. En aves, estas se utilizan suplementadas en agua o alimento, o inyectadas

in ovo (Attia et al., 2012; Kogut y Arsenault, 2016; Dunislawska et al., 2017).

El término probiótico designa a las microorganismos vivos que, administrados en

cantidades adecuadas, confieren efectos beneficiosos para la salud de los seres

humanos y los animales (FAO/OMS, 2006). Para que un microorganismo sea

considerado un probiótico ideal, debe cumplir una serie de características establecidas

(Kabir, 2009; Marie y Smith, 2014):

Apatogénico: todas las especies deben ser consideradas seguras, no haberse

reportado efectos adversos y no presentar resistencia a antibióticos (Tuomola

et al., 2001; Marie y Smith, 2014).

Capacidad de adhesión a los enterocitos: se reportó una mejora productiva y

protectiva a partir de bacterias del género Lactobacillus aisladas de aves con la

capacidad de adherirse a los enterocitos de aves, a diferencia de las

provenientes de mamíferos que no provocarían beneficios (Fuller, 1973, 1975,

1977; Fuller y Brooker, 1974). Esta adhesión provoca una competencia con las

28

bacterias patógenas por los sitios de anclaje, por exclusión competitiva (Nurmi

y Rantala, 1973), y genera un estímulo sobre la mucosa que modula la función y

morfología. Algunos autores consideran que esta característica es la de mayor

importancia (Dunislawska et al., 2017). Sin embargo, otras características

entran en juego para lograr efectividad en el probiótico (Marie y Smith, 2014).

Habilidad de colonizar y multiplicarse en el huésped: una bacteria probiótica

efectiva debe colonizar, reproducirse y convertirse en el microorganismo

predominante de la microbiota intestinal. La adhesión, aunque no

determinante ni indispensable, favorece la colonización. Se estima que un

organismo colonizó el intestino cuando varios días posteriores se puede aislar

de heces o por hisopado cloacal (Marie y Smith, 2014).

Específico de huésped: la bacteria utilizada debe ser habitante normal de la

microbiota en la especie animal a la que se destinará, siendo esta una

característica esencial para la efectividad del probiótico. Aún se debe estudiar

la posibilidad de utilizar bacterias adherentes de distintas especies de aves;

Fuller (1973) y Fuller y Brooker (1974) obtuvieron resultados positivos in vitro.

Algunos reportes en psitácidas denotan efectividad en la utilización de

bacterias de origen cruzado. Sin embargo, se considera que las bacterias

específicas de huésped son más efectivas (Marie y Smith, 2014).

Habilidad de sobrevivir el recorrido por el tracto digestivo: los probióticos

deben resistir a la exposición al ácido estomacal en proventrículo (pH 4,8) y

ventrículo (pH 2,5), y a la bilis en intestino (pH 5,7-6,0). Por esto, en los

estudios sobre bacterias con potencial probiótico se realizan pruebas in vitro

que simulan las condiciones del tracto digestivo, y la identificación in vivo del

microorganismo en intestino (Kabir, 2009; Marie y Smith, 2014).

Producción de metabolitos inhibitorios: entre estos se encuentran ácidos

orgánicos —e.g. ácido láctico, ácido acético— que descienden el pH intestinal,

bacteriocinas —e.g. reuterina de L. reuteri— y defensinas. La producción de

estos compuestos dependerá de la especie actuante (Fuller y Brooker, 1974;

Marie y Smith, 2014).

29

Modulación de la respuesta inmune gastrointestinal: los probióticos inducen y

mejoran la respuesta inmunitaria del intestino, tanto por producción de

citoquinas, de anticuerpos o por incremento de la respuesta local. Al mismo

tiempo, pueden inducir cambios morfológicos que mejoran la resistencia, como

aumentar la cantidad de células de Goblet y la secreción de mucus. Los efectos

inmunitarios de las bacterias probióticas siguen en estudio (Marie y Smith,

2014).

Habilidad de sobrevivir el procesamiento y almacenamiento: la bacteria debe

ser capaz de crecer en un medio artificial y sobrevivir a la congelación,

almacenamiento y reconstitución, así como a las condiciones de

almacenamiento de los alimentos con los cuales de mezclará. Así, en los

estudios se realizan pruebas de viabilidad para vida útil, condiciones de

almacenamiento y de administración (Marie y Smith, 2014).

La administración de microbiota indefinida no es aceptada por las agencias en algunos

países por el potencial riesgo de transmisión de enfermedades (Methner et al., 1997).

La bacteria que se esté considerando debe contar con su caracterización in vitro,

identificando su estabilidad genotípica y fenotípica, estabilidad de plásmido, patrones

de resistencia a antibióticos, y patrones de utilización de carbohidratos y proteínas, así

como también características que hacen a su propiedad de probiótico mencionadas

previamente (resistencia a las condiciones del tracto digestivo, la capacidad de

adhesión, producción de bacteriocinas, etc.). Luego, se debe proceder con la

demostración de efectos probióticos in vitro e in vivo, y finalmente su viabilidad en

condiciones de almacenamiento y procesos industriales (Tuomola et al., 2001; Kabir,

2009; Blajman et al., 2015).

30

Figura II.10. Diagrama de flujo de la selección de probiótico en la industria avícola.

Es de destacar la cantidad de pasos que se deben cumplir hasta obtener un

producto comercial aprobado. Adaptado de Kabir (2009).

USOS Y BENEFICIOS

Los probióticos son utilizados básicamente con dos fines: la prevención y tratamiento

de enfermedades bacterianas al suprimir patógenos intestinales; y la promoción del

crecimiento por mejoramiento de conversión alimenticia, ganancia de peso y salud

intestinal al promover la microbiota benéfica (Blok et al., 2002; Apajalahti, Kettunen y

Graham, 2004; Kabir, 2009; Marie y Smith, 2014; Blajman et al., 2015).

31

La vía y el momento de la administración determinarían la capacidad de la bacteria

probiótica de colonizar el intestino y modular la microbiota. Entre las vías más

utilizadas en pollos parrilleros se encuentran la inclusión en agua de bebida, la

aspersión, el agregado al alimento y las dosis individuales. Comúnmente, se utiliza la

administración en alimento o en agua de bebida inmediatamente luego de la eclosión

(Alloui, Szczurek y Świątkiewicz, 2013), ya que es recomendable administrarlos lo más

tempranamente posible, y en ese momento el individuo cuenta con una microbiota en

formación, logrando una alta efectividad de la suplementación (Pedroso, Menten y

Lambais, 2005; Dunislawska et al., 2017). Algunos estudios demuestran una mejor

eficacia en la administración a través del agua de bebida en comparación al alimento,

especialmente el peletizado donde el procesamiento podría reducir la carga

bacteriana.

Por otra parte, la aspersión luego de la eclosión permite una administración rápida y

homogénea, y la administración individual por vía ingluvial sólo es utilizada en ensayos

científicos, ya que permite un mayor control sobre la dosis y administración (Blajman

et al., 2015).

Otra alternativa es la administración in ovo, ya que la microbiota comienza a

establecerse durante la incubación (Pedroso, Menten y Lambais, 2005; Pedroso, 2009),

por lo que se promovería la colonización del tracto digestivo y el efecto desde el

período pre-eclosión (Dunislawska et al., 2017). La inoculación in ovo lograría mejores

desempeños productivos y una mejor protección frente a patógenos. Sin embargo,

esta técnica necesita mayor desarrollo para su aplicación en producción comercial

(Leandro et al., 2010).

Se conoce la capacidad de los probióticos de prevenir enfermedades, y reducir el

número de patógenos en los animales y sus heces. Excepto algunos, la gran parte de

los estudios sobre probióticos se basan en un diseño donde la administración del

probiótico se realiza previamente al desafío patógeno. El uso preventivo es mucho más

efectivo que el terapéutico, por lo cual se recomienda la administración en pollitos

recién nacidos para lograr el establecimiento de una microbiota saludable y la

inducción de las defensas inmunitarias del intestino. Igualmente recomendable son las

32

administraciones periódicas, posteriores a tratamiento antibióticos y previas a

situaciones de estrés para restablecer la microbiota cuando existe un limitado contacto

con otros animales de la misma especie (Raja, Raja e Imran, 2009; Marie y Smith, 2014)

Figura II.11. Representación esquemática del concepto de probióticos. Se

simboliza cómo la restricción al contacto del pollito recién nacido con adultos

lleva a la presencia de una microbiota incompleta y débil que lo vuelve susceptible

a los patógenos. Los probióticos complementan la microbiota y brindan la

protección necesaria. Adaptado de Kabir (2009).

La resistencia a la colonización con Salmonella podría ser mejorada en los animales por

una exposición temprana a microorganismos intestinales que dirigen la base

nutricional del intestino en desarrollo y promueve el desarrollo de la microbiota

intestinal que suprime el crecimiento o la producción de toxinas por parte de

patógenos. Así, los probióticos pueden ser una vía efectiva en la reducción de

prevalencia y severidad de enfermedades (Pedroso y Lee, 2015).

Como promotores de crecimiento ya se han probado sus efectos positivos en varias

especies animales, logrando mejores tasas de crecimiento y de conversión alimenticia.

Esto lo logran por sus efectos inhibitorios sobre otros microorganismos, la mejora de la

33

digestión y absorción de nutrientes, incremento de enzimas digestivas, y cambios

histomorfológicos que llevan a una mayor superficie de absorción en la mucosa —

aumento de altura de vellosidades y profundidad de criptas (Marie y Smith, 2014;

Olnood et al., 2015a). También, las bacterias probióticas liberan productos que

resultan esenciales para el huésped, como vitaminas del grupo B y aminoácidos (Attia

et al., 2012), y mejorarían las características cualitativas de la carne producida (Kabir,

2003).

Los probióticos deberían mejorar la performance del animal tanto o más que los

antibióticos promotores del crecimiento (Huyghebaert, Ducatelle y Van Immerseel,

2011). Sin embargo, los datos de la amplia literatura sobre probióticos indican

resultados diversos (Blajman et al., 2015), tal vez debidos a diferencias en dosis y

características de las cepas probióticas utilizadas en los estudios, así como también el

estado de los animales y el balance de sus microbiotas (Huyghebaert, Ducatelle y Van

Immerseel, 2011), ya que la magnitud de la mejora depende del tipo de probiótico, la

cepa bacteriana y las condiciones bajo las que se utiliza (Apajalahti, Kettunen y

Graham, 2004; Olnood et al., 2015a). Loddi (2003) propone que los probióticos

favorecerían el desempeño de las aves cuando estas están bajo situaciones no

adecuadas, bajo desafío sanitario o con desequilibrio en su microbiota.

Entre los géneros que han demostrado efectos beneficiosos, tanto productivos como

sanitarios, en producción de pollos parrilleros se encuentran Lactobacillus,

Streptococcus, Bacillus, Bifidobacterium, Enterococcus, Aspergillus, Candida y

Saccharomyces (Blok et al., 2002; Kabir, 2009; Pedroso y Lee, 2015).

MECANISMOS DE ACCIÓN

Para lograr sus efectos, los probióticos tienen diversos mecanismos de acción, cuya

expresión variará con la especie y cepa bacteriana. Entre estos mecanismos se

encuentran los siguientes (Kabir, 2009; Chaucheyras-Durand y Durand, 2010;

Huyghebaert, Ducatelle y Van Immerseel, 2011; Blajman et al., 2015):

34

Exclusión competitiva: a través de la competencia directa con los patógenos,

por adhesión a receptores del epitelio y por los nutrientes presentes en el

lumen intestinal, los probióticos evitan que el intestino sea un nicho disponible

para los patógenos; de este modo, también se mantiene una microbiota

intestinal normal.

Producción de sustancias antimicrobianas: estos metabolitos con actividad

contra los patógenos pueden ser bacteriocinas —e.g. reuterina producida por

L. reuteri—, enzimas que hidrolicen las toxinas bacterianas, peróxido de

hidrógeno, diacetilo, o ácidos orgánicos —ácido láctico, acético, propiónico. La

bacteria probiótica puede producir uno o más de estas sustancias. Las

bacteriocinas actúan dañando la pared celular de los patógenos. Los ácidos

orgánicos, por su parte, reducen el pH luminal, creando un ambiente

desfavorable para los patógenos pero propicio para la microbiota.

Inmunoestimulación: los probióticos estimulan el sistema inmunitario

generando mayor actividad de los macrófagos, con mayor capacidad fagocítica,

aumentando la producción de anticuerpos circulantes y locales, y la de

interferón y otras citoquinas. Los mecanismos de inmunomodulación aún no

están del todo claros.

Alteración metabólica: los probióticos provocarían el aumento de la actividad

enzimática en el tracto digestivo y generarían una reducción de la actividad

enzimática y producción de amoníaco por parte de las bacterias. La alteración

del pH, causada por los ácidos orgánicos, también tiene efecto sobre la

actividad enzimática intestinal y digestibilidad de los nutrientes.

35

Figura II.12. Ilustración de los posibles efectos de bacterias probióticas. Los

probióticos (azul) cumplen su función protectora a través de diversos mecanismos

directos, actuando sobre los patógenos (verde), e indirectos, estimulando

respuestas orgánicas. Adaptado de Blok et al. (2002).

EL CASO DE LACTOBACILLUS

En muchos países, es común la utilización de probióticos de bacterias y levaduras en la

producción avícola, siendo Lactobacillus el género de mayor difusión en el uso para

mejorar la conversión alimenticia o en el control de Salmonella. Sin embargo, suele ser

difícil conseguir los permisos de las agencias reguladoras para utilizar las preparaciones

en producción avícola (Waters, Murphy y Power, 2006).

Las bacterias ácido-lácticas conforman los probióticos más utilizados porque previenen

la adhesión de los patógenos en la mucosa intestinal y liberan enzimas hacia el lumen

(Naidu, Bidlack y Clemens, 1999). Sin embargo, en algunos casos, se vieron

36

Lactobacillus específicos de especie y con capacidad de adhesión que no han generado

beneficios, especialmente frente a desafíos con Salmonella (Marie y Smith, 2014).

Bacterias del género Lactobacillus se presentan en el intestino de aves sanas, siendo

varias las especies presentes que podrían colonizar (Lan, Sakamoto y Benno, 2004), lo

que, junto a sus características protectoras y sus efectos benéficos sobre el huésped,

las convierte en una buena opción para el desarrollo de probióticos (Raja, Raja e Imran,

2009). Entre las especies más comúnmente utilizadas en producción avícola se

incluyen: L. acidophilus, L. agilis, L. brevis, L. bulgaricus, L. casei, L. fermentum, L.

helveticus, L. lactis, L. paracasei, L. plantarum, L. reuteri, L. salivarius, (Kabir, 2009;

Pedroso y Lee, 2015).

Los Lactobacillus participan activamente en los procesos fermentativos, poseen

actividad inhibitoria ante microorganismos patógenos, neutralizan enterotoxinas,

sintetizan vitaminas y estimulan la respuesta inmune, y mejoran la disponibilidad y

absorción de nutrientes y utilización de energía de la dieta, con un mejor estado de las

vellosidades (Mroz et al., 2000; Segura y De Bloss, 2000; Jacela et al., 2010; Rondón

et al., 2013).

Actualmente, los efectos de Lactobacillus como probiótico han sido estudiados

ampliamente, tanto en su uso como cultivos puros como en mezclas de cepas o con

otros géneros bacterianos, con distintos objetivos. De la revisión bibliográfica se

observa que los resultados son variables; la Tabla II.1 presenta un resumen de algunos

de los trabajos al respecto. Las diferencias pueden ser atribuidas a las distintas cepas

utilizadas, las dosis, el manejo, etc. (Olnood, Beski, Choct e Iji, 2015). Por esto, se

considera que el impacto del uso de Lactobacillus en sanidad y performance animal es

controversial, a pesar de ser un género adecuado para el desarrollo de probióticos por

sus beneficios sobre la microbiota intestinal (Raja, Raja e Imran, 2009).

37

Autor Probiótico Desafío Salud Perform. Histol.

Attia et al. (2012)

L. acidophilus Saccharomyces

cerevisiae Bacillus subtilis

Aspergillus oryzae

Salmonella Enteritidis

+ n/s n/e

Awad et al. (2009) Lactobacilllus sp. — n/e + +

Brisbin et al. (2010, 2011)

L. acidophilus L. reuteri

L. salivarius — + n/e n/e

Fuller (1977) Lactobacillus sp. E. coli + n/e n/e

Higgins et al. (2010)

L. casei L. delbrueckii subsp.

bulgaricus L. fermentum

Salmonella Enteritidis

Desafío previo: + Des.post

.: n/s

n/e n/e

Kizerwetter-Świda y Binek (2008)

L. salivarius Salmonella

Enteritidis + Cl. perfringens

+ n/e n/e

Layton et al. (2013) L. salivarius,

Pediococcus parvulus

S. Typhimurium + Cl. Perfringens Eimeria maxima

+ + n/s

Mookiah et al. (2013) L. reuteri, L.

gallinarum, L. brevis, L. salivarius

— n/e + n/e

Mountzouris et al. (2007)

Lactobacillus sp. — + n/e n/e

Murate et al. (2015)

L. acidophilus, L. casei, B. subtilis,

Enterococcus faecium, Bifidobacterium

longum

Salmonella Enteritidis

n/s n/e n/e

Olnood et al. (2015a) L. johnsonii — n/e + n/s

Olnood et al. (2015b) L. johnsonii Salmonella

Sofia + n/s n/s

Pelicano et al. (2005)

L. acidophilus, L. casei Streptococcus lactis

Bifidobacterium bifidus Arpergillus oryzae

— n/e n/e +

Raja, Raja e Imran (2009) L. fermentum — + + n/e

Watkins, Miller y Neil (1982)

L. acidophilus E. coli + n/e n/e

Watkins y Kratzer (1983) Lactobacillus sp. Coliformes normales

+ n/e n/e

Tabla II.1. Resumen de efectos de diferentes especies de Lactobacillus. Puede

inferirse una variabilidad en la metodología y los resultados de los estudios. |

Salud: estimulación inmunitaria y/o protección frente a patógenos. Performance:

características productivas —i.e. peso corporal, ganancia de peso, conversión

alimenticia. Histología: parámetros histomorfométricos del tracto digestivo —i.e.

altura de vellosidades, profundidad de criptas, relación vellosidades:criptas,

recuento de células, etc. | (+) efecto positivo, (n/s) diferencias no significativas,

(n/e) no estudiado.

38

SALMONELOSIS

Las infecciones provocadas por bacterias del género Salmonella producen

enfermedades tanto agudas como crónicas en la producción avícola, lo cual se traduce

en grandes pérdidas económicas. A su vez, estas infecciones tienen gran importancia

en la salud pública, siendo las aves de producción los reservorios más importantes de

enfermedades transmitidas por los alimentos de estas bacterias. Esto lleva a presiones

permanentes sobre los productores por parte de las autoridades de salud pública con

el objeto de asegurar la inocuidad de los alimentos derivados de esta producción

(Swayne, 2013).

En general, se suele dividir a las infecciones por Salmonella en tres grupos: pullorosis y

tifosis, causadas por S. Pullorum y S. Gallinarum, respectivamente; paratifosis,

causadas por varios serotipos móviles; y arizonosis, causada por S. enterica subsp.

arizonae (Shivaprasad, 2000; Swayne, 2013).

La pullorosis —o diarrea blanca bacilar— y la tifosis se estudian en conjunto ya que

comparten similitudes en su signología, lesiones, epidemiología, tratamiento y control.

Estas son enfermedades septicémicas que afectan a las gallinas, entre otras aves de

producción, cuyos serovares son altamente adaptados al huésped, causando

raramente enfermedad en huéspedes no aviares. La tifosis es una enfermedad

septicémica aguda o crónica que usualmente afecta a las aves adultas, mientras que la

pullorosis es una enfermedad sistémica aguda más común en aves jóvenes

(Shivaprasad, 2000; Barrow y Freitas Neto, 2011; Swayne, 2013).

La salmonelosis paratífica involucran gran variedad de serotipos, afectando distintos

huéspedes tanto de forma subclínica como clínica. Los serotipos involucrados son de

importancia para la salud pública ya que son frecuentes agentes de salmonelosis en

humanos (Swayne, 2013).

La arizonosis es una enfermedad septicémica que afecta principalmente a las crías de

pavos, causada por S. enterica subesp. arizonae (S. arizonae). También son

susceptibles las gallinas, los patos y aves silvestres. Esta enfermedad es indistinguible

de otras enfermedades causadas por otros serotipos de Salmonella. Para la salud

39

pública no implica un riesgo, ya que no se han reportado casos de arizonosis en

humanos relacionados con aves (Swayne, 2013). Al ser una enfermedad que afecta

principalmente la producción de pavos, no será desarrollada en la presente tesina.

GÉNERO SALMONELLA

El género Salmonella, perteneciente a la familia Enterobacteriaceae, incluye gran

variedad de bacterias Gram negativas, bacilos, no esporogénicas y anaerobias

facultativas, las cuales se agrupan en 2 especies genéticamente diversas: S. enterica y

S. bongori. La taxonomía se basa en pruebas bioquímicas en subgéneros y en la

división serológica de serotipos con denominación de especie según el esquema

Kauffmann-White, de acuerdo con la estructura antigénica de los polisacáridos de

pared celular —antígenos somáticos O—, de los flagelos —antígenos H— y cápsula —

antígenos Vi— (Nicolet, 1986; Acha y Szyfres, 2001; Dunkley et al., 2009; Leedom

Larson y Spickler, 2013; Swayne, 2013).

S. enterica consiste en 6 subespecies [S. enterica subesp. enterica (I), S. enterica

subesp. salamae (II), S. enterica subesp. arizonae (IIIa), S. enterica subesp. diarizonae

(IIIb), S. enterica subesp. houtenae (IV) y S. enterica subesp. indica (VI)], siendo la

subespecie enterica la de mayor importancia en animales de producción. Esta última

incluye más de 2500 variedades, llamadas serotipos. Aquellos serotipos relacionados

con infecciones en aves de producción se encuentran dentro de una misma especie,

Salmonella enterica (Nicolet, 1986; Swayne, 2013).

S. Pullorum y S. Gallinarum son serotipos de S. enterica específicos de gallinas (Foley et

al., 2007), que se debate si en realidad corresponderían a un mismo taxón, por lo que

también se las nombra como S. enterica subesp. enterica serovar Pullorum-Gallinarum.

En otros esquemas de clasificación, se las denomina S. enterica serovar Gallinarum

biovar gallinarum y pullorum, según diferencias bioquímicas y epizootiológicas. Sin

embargo, cada serotipo causa una enfermedad diferente (Shivaprasad, 2000; Acha y

Szyfres, 2001; Swayne, 2013).

40

Dichos serotipos son bacterias inmóviles cuyas colonias en agar infusión o extracto de

carne son pequeñas, discretas, suaves, azul-grisáceas o blanco-grisáceas, brillantes,

homogéneas y enteras (Shivaprasad, 2000). El crecimiento en caldos es túrbido con

sedimento de flóculos. La diferenciación bioquímica resulta dificultosa, por lo cual se

realizan técnicas de biología molecular para la diferenciación. Entre los antígenos que

presentan, se encuentran antígenos O 1, 9 y 12. Sus factores de virulencia incluyen

endotoxinas, toxinas de diversa acción, capacidad de adherencia y un plásmido de 85

kb, el cual es intercambiable con otros serotipos de Salmonella (Swayne, 2013).

Los serotipos de las enfermedades paratíficas son S. Enteritidis y S. Typhimurium, los

cuales son bacterias móviles, no específicas de huésped. Ambos serotipos son bacilos

rectos, con flagelos perítricos que les brindan motilidad. Sus colonias en agar son

típicamente redondas, de 2-4 mm, con bordes suaves, brillantes y levemente elevadas.

Presentan antígenos somáticos O y flagelares H. Entre sus factores de virulencia se

encuentran endotoxinas asociadas a lipopolisacáridos de pared celular, toxinas,

plásmidos, y fimbrias y flagelos que brindan la capacidad de adhesión e invasión. Los

aspectos relativos a la infección, como colonización del tracto digestivo e invasión de

órganos internos, varían dependiendo los serotipos involucrados (Swayne, 2013).

Figura II.13. Microfotografías de dos cepas de Salmonella Typhimurium captadas

por microscopía electrónica. En estas imágenes se puede apreciar la morfología

bacilar y la presencia de flagelos, los cuales están en la mayoría de los serotipos

(Tomoyasu et al., 2002).

41

Bioquímica SP SG SE ST SA

Motilidad - - + + +

Arabinosa + + s/d s/d s/d

Dextrosa + / Gas + s/d s/d + / Gas

Galactosa + + s/d s/d s/d

Manitol + + / Gas + + +

Manosa + + s/d s/d s/d

Ramnosa + + s/d s/d s/d

Xilosa + + s/d s/d s/d

Lactosa - - - - +

Sucrosa - - - - s/d

Salicina - - - - s/d

Dulcitol - + + + -

Maltosa - / + - + + +

Descarboxilación de ornitina + - + + +

Descarboxi. de malonato s/d s/d - - s/d

Descarboxi. de lisina s/d s/d + + s/d

Descarboxil. de arginina s/d s/d s/d s/d +

Producción de glucógeno - - + + +

Citrato s/d s/d + + s/d

Glucosa s/d s/d + + s/d

Mucato - s/d + + s/d

Gas s/d - + + +

SH2 - - + +

Reducción De nitrato s/d s/d + + +

Urea - - - - -

Indol - - - - -

Inositol s/d s/d s/d s/d -

Rojo de metilo s/d s/d s/d s/d +

Liquefacción de gelatina s/d s/d s/d s/d +

Cianido potásico s/d s/d s/d s/d -

Beta-Galactosidasa s/d s/d s/d s/d +

Fenilalanina desaminasa s/d s/d s/d s/d -

Aglutinación + + s/d s/d s/d

Tabla II.2. Caracterización bioquímica de cinco especies de Salmonella. SP.

Salmonella Pullorum, SG. Salmonella Gallinarum, SE. Salmonella Enteritidis, ST.

Salmonella Typhimurium, SA. Salmonella Arizonae; (+) positivo, (-) negativo, (s/d)

sin datos. Adaptada de Shivaprasad (2000) y Swayne (2013).

42

IMPORTANCIA EN SALUD PÚBLICA

A excepción de S. typhi y S. paratyphi A y C que son estrictamente de humanos, todos

los serotipos de Salmonella son considerados zoonóticos o potencialmente zoonóticos

(Acha y Szyfres, 2001; Leedom Larson y Spickler, 2013).

La salmonelosis en humano es muy común, presentándose como casos esporádicos o

estallidos, afectando una familia o grupos de personas. Su incidencia real, en especial

en países en desarrollo, es difícil de estimar por la ausencia de sistemas de vigilancia

epidemiológica y la no notificación de los casos esporádicos y leves (Acha y Szyfres,

2001). Sin embargo, se estima que produce aproximadamente 1,3 mil millones de

casos anualmente en el mundo (Coburn, Grassl y Finlay, 2007; Arun K. Bhunia, 2008).

Figura II.14. Esquema del modo de transmisión de salmonelosis en humano, a

excepción de las especies de S. typhi y serotipos paratíficos (Acha y Szyfres,

2001).

Los principales síntomas en humanos son enterocolitis o diarrea, fiebre, náuseas,

vómitos, dolor de cabeza y abdominal (Coburn, Grassl y Finlay, 2007; Akpabio, 2015),

se presentan entre 6 y 48 horas post-infección y persisten por uno o dos días. Los

niños, los ancianos y las personas inmunodeprimidas son los más susceptibles

(Akpabio, 2015).

43

Tanto S. Pullorum como S. Gallinarum raramente llegan a la cadena de alimentos de

los humanos, por lo cual la casuística de estos serovares es muy baja (Barrow y Freitas

Neto, 2011; Swayne, 2013). Entre los signos clínicos para estos casos, se observa

enteritis aguda con rápida recuperación sin necesidad de tratamiento (Swayne, 2013).

Los serotipos de las paratíficas son los principales causantes de enfermedades

transmitidas por alimentos, siendo la carne de pollo y los huevos los mayores vehículos

(Foley, Lynne y Nayak, 2008; Leedom Larson y Spickler, 2013). Esto se debe a que

muchos de los serotipos de mayor prevalencia en humanos son comunes en aves —i.e.

S. Enteritidis y S. Typhimurium. S. Enteritidis es el serotipo más frecuente en muchos

países (Kang et al., 2017). Estas causan enfermedades generalmente autolimitantes,

siendo gastroenteritis la principal presentación, pero también puede producirse

enfermedad sistémica (Leedom Larson y Spickler, 2013).

Un enfoque de manejo holístico es necesario para reducir el impacto de Salmonella en

la salud pública (Foley, Lynne y Nayak, 2008). Los mercados internacionales están

sujetos a restricciones en base a la seguridad sanitaria de los productos derivados de la

producción avícola (Swayne, 2013).

EPIDEMIOLOGÍA DE SALMONELOSIS AVIAR

El hábitat normal de las salmonelas es el tracto gastrointestinal de los animales,

incluyendo el humano, y son comúnmente asociadas a comidas como carne cruda, y

productos avícolas y lácteos (Foley, Lynne y Nayak, 2008; Akpabio, 2015). Su

distribución es mundial, y existe asociación entre los serotipos aislados de los animales

y de los humanos en las mismas regiones o países (Acha y Szyfres, 2001).

El contagio entre animales puede ocurrir directamente o indirectamente a través de

alimento contaminado, vehículos, entre otros (Nicolet, 1986), siendo los animales

portadores los principales causantes de diseminación y contagio, tanto por sus heces

como por sus huevos (Acha y Szyfres, 2001). A su vez, las bacterias de este género

pueden sobrevivir mucho tiempo en suelo y agua (Organización Mundial de la Salud,

1988).

44

Pullorosis y tifosis presentan distribución mundial, con baja incidencia en países

desarrollados (e.g. Canadá, Australia, Japón, Estados Unidos, y países de Europa

Occidental); sin embargo, en Latinoamérica, África, China e India aún se reportan casos

de ambas enfermedades. México se auto-declaró libre de pullorosis en 2002, pero

hubo brotes de tifosis en 2005 y 2007, y en Brasil ocurrieron brotes de pullorosis en

2004 y de tifosis en 2005 y 2008. En el caso de Argentina, se reportaron brotes en 2005

y 2008. Sin embargo, como se ha aclarado previamente para humano, los datos

disponible no permiten establecer con certeza la ocurrencia y distribución de estas

enfermedades en la mayoría de los países (Shivaprasad, 2000; Barrow y Freitas Neto,

2011).

Las gallinas son el huésped natural, pero otras aves de producción y silvestres pueden

infectarse y enfermar, a excepción de los patos. Incluso distintas líneas genéticas

presentan diferencias en susceptibilidad, siendo las aves livianas (e.g. White Leghorns)

más resistentes que las pesadas (e.g. Rhode Island Red, New Hampshire) o sus cruzas

(Shivaprasad, 2000). En cuanto a la edad, los pollitos de hasta 2-3 semanas son más

susceptibles a la pullorosis, viéndose mortalidad, y ocasionalmente produce

infecciones agudas en aves mayores; mientras que la tifosis se considera una

enfermedad de aves adultas, pero hay registros de mortalidad en gallinas jóvenes,

principalmente en el primer mes de vida. Así, los pollitos son altamente susceptibles a

ambos serotipos, pero los adultos lo son más a S. Gallinarum.(Barrow y Freitas Neto,

2011; Swayne, 2013). Ambos sexos son capaces de desarrollar estado de portador,

pero la diseminación al tracto reproductivo sólo ocurre en gallinas, relacionándose con

el inicio de la puesta de huevo (Barrow y Freitas Neto, 2011). Otros factores que

afectan la susceptibilidad son: el serotipo y la dosis infectiva; manejo del lote; estrés,

tanto ambiental, por transporte o enfermedades subclínicas; aditivos alimenticios,

como antibióticos y coccidicidas; supervivencia a pH bajo estomacal; competencia con

la microbiota intestinal; presencia de un sitio de colonización; y la base genética del

huésped (Shivaprasad, 2000; Foley, Lynne y Nayak, 2008)

La transmisión ocurre, principalmente, por vía de aves infectadas —reactores y

portadores—, tanto en sentido horizontal como vertical. La transmisión horizontal

ocurre a través de la materia fecal, por contaminación del alimento, el agua y la cama.

45

La transmisión vertical, por la cual el huevo es objeto de infección, podría ocurrir

previamente a la ovulación, durante la bajada del huevo o luego de la postura por

pasaje de las bacterias a través de la cáscara. Los pollitos infectados al nacer pueden

transmitir el patógeno a los individuos sanos con los cuales comparten la incubadora y

muchos de los que no mueren pueden constituirse en portadores. También

participarían en la transmisión y diseminación el personal de la granja, y toda persona

que ingrese a la misma, y animales silvestres, tanto aves y mamíferos como insectos

(Shivaprasad, 2000; Acha y Szyfres, 2001; Swayne, 2013; Akpabio, 2015).

La infección ocurre vía oral, para luego ocurrir una invasión de células epiteliales de

intestino o de tejido linfoideo, principalmente placas de Peyer y tonsilas cecales. Luego

ocurre una diseminación hacia órganos internos —hígado, bazo y médula ósea—.

La distribución de los serotipos de Salmonella de fuentes avícolas varía geográfica y

temporalmente, aunque algunos serotipos presenten constantemente alta incidencia.

En muchos países, se ha reportado una asociación entre los serotipos en aves y

aquellos aislados en humanos. La asociación epidemiológica de S. Enteritidis con

enfermedad transmitida por huevos ha provocado interés en la prevalencia de este

serotipo en varios países, aunque también ha sido aislada en producciones de

parrilleros en algunos países. Otros serotipos de alta prevalencia en pollos parrilleros

son: S. Typhimurium, S. Heidelberg, S. Hadar, S. Mbandaka, y S. Anatum. La prevalencia

actual de lotes positivos a Salmonella varía considerablemente, y la incidencia no

necesariamente se correlaciona con la prevalencia de infección dentro del lote o la

contaminación de las instalaciones (Swayne, 2013).

Las salmonelas paratíficas provocan afecciones diferentes a pollitos recién nacidos que

a adultos. En los pollitos, puede ocurrir enfermedad y generalmente muerte (Lister,

1988), con pico a los 3-7 días de vida. En estos, la colonización intestinal, la invasión

sistémica —bazo, hígado y vesícula biliar, entre otros órganos— y persistencia es

mayor que en adultos. Las aves mayores son menos susceptibles, por lo cual pueden

sufrir colonización intestinal y diseminación sistémica sin morbilidad y mortalidad

significativas. A su vez, la incidencia de la colonización y mortalidad dependerá de la

dosis infectiva (Swayne, 2013).

46

La transmisión de las salmonelas paratíficas puede ocurrir a través de animales

infectados por contacto directo, o a través de sus heces, por ingestión de alimento,

agua y cama contaminados, por vectores que diseminan y amplifican, animales

silvestres reservorios, aerosoles, polvo, y los operarios y equipos de la granja. También

puede ocurrir la transmisión vertical a través de huevos contaminados interna o

externamente, por transmisión transovárica o por las cáscaras contaminadas con

heces, respectivamente (Barrow, 1991). Esta transmisión es de gran importancia, sobre

todo en incubadoras. Se entiende que los pollitos al nacer presentan una microbiota

intestinal “débil” que no ejerce la función protectora de una forma completa, por lo

cual son muy susceptibles a la colonización intestinal de Salmonella, y, sumado a la

inmadurez del sistema inmunitario para responder vía celular de manera efectiva, los

patógenos encuentran un nicho donde replicarse, esperándose una alta tasa de

mortalidad. El desarrollo de la resistencia en aves jóvenes se atribuye a la adquisición

de una microbiota intestinal protectora que compita con los patógenos, ya sea por

competencia por espacio como a través de factores inhibitorios (Holt et al., 1999;

Barrow y Freitas Neto, 2011; Swayne, 2013).

La morbilidad y mortalidad son variables, influyendo la edad, la raza, nutrición,

manejo, enfermedades concurrentes, y ruta y dosis infectiva. La morbilidad suele ser

mayor que la mortalidad, ocurriendo recuperación espontánea de aves afectadas que

persisten como portadoras (Swayne, 2013).

ASPECTOS CLÍNICOS: SIGNOLOGÍA

La tifosis es de mayor importancia en gallinas en crecimiento y adultas que la

pullorosis. En los casos de infección del huevo, pueden verse pollitos moribundos o

muertos. Los vivos pueden verse somnolientos, débiles, inapetentes, de pobre

crecimiento, a lo cual puede seguirle la muerte. En caso de pullorosis, pueden verse

mayores afecciones a los 7-10 días de vida, donde se ve a los pollitos agrupados bajo la

fuente de calor, con las alas caídas, con disnea y jadeo, y diarrea con heces adherida,

con un pico de mortalidad a la segunda semana. También se observa ceguera, y

afecciones articulares y sinovitis. Aquellas aves que sobreviven permanecen como

47

portadoras crónicas. El curso crónico lleva a un pobre crecimiento, mala calidad de

plumaje, degeneración de folículos, ooforitis, peritonitis y eliminación entérica

(Nicolet, 1986; Shivaprasad, 2000; Swayne, 2013). Como los signos son variables y no

específicos, la muerte de pollitos sin eclosionar y recién nacidos es uno de los mejores

indicativos de la enfermedad (Dunkley et al., 2009). Por su parte, en aves adultas, estas

infecciones pueden presentarse como casos subclínicos. La tifosis presenta reducción

del consumo, plumas revueltas, y caída en la producción de huevos, fertilidad e

incubabilidad, con muerte a los 5-10 días post-infección. La pullorosis en adultos

provoca anorexia, diarrea, pérdida de peso, depresión y deshidratación (Shivaprasad,

2000; Swayne, 2013).

Las infecciones paratíficas causan enfermedad clínica en aves jóvenes. Es posible la

ocurrencia de mortandad de embriones o muerte de pollitos recién nacidos a causa de

contaminación del huevo. La morbilidad y mortalidad suelen ser altas los primeras dos

semanas de vida, con afecciones relacionadas a la ganancia de peso y retraso de

crecimiento. El curso generalmente es corto, con signos similares a otras

enfermedades por Salmonella u otras bacterias septicémicas. En pollitos, los signos

incluyen somnolencia, ojos cerrados, alas caídas, plumas revueltas, temblores y diarrea

profusa; a veces, ceguera y laminitis. En adultos, suele tener un curso inaparente, pero

S. Enteritidis puede provocar anorexia, diarrea y caída de producción de huevos en

gallinas ponedoras. Estos animales se vuelven portadores crónicos (Nicolet, 1986;

Swayne, 2013).

ASPECTOS CLÍNICOS: LESIONES PATOLÓGICAS

Las lesiones tanto micro como macroscópicas en pullorosis y tifosis dependen del

curso de la enfermedad, viéndose principalmente en pollitos. En casos hiperagudos, el

ave muere sin lesiones macroscópicas. En los casos agudos, se observa hepatomegalia,

esplenomegalia y renomegalia. El hígado puede presentar pequeños focos blancos, al

igual que los pulmones, y el saco vitelino puede tener alguna anormalidad que

interfiera con la absorción de la yema, siendo su contenido coagulado, cremoso o

caseoso. El corazón y páncreas pueden presentar nódulos blancos, confundibles con

48

tumores de enfermedad de Marek, junto a otras afecciones en peri y miocardio.

Ocasionalmente, se ven nódulos en ciegos y colon. En adultos, las lesiones son menos

frecuentes y se limitan en general a la formación de nódulos. Así, se puede observar

nódulos en folículos ováricos o folículos en regresión, exudado caseoso en oviducto

con disfunción ovárica y oviductal, o nódulos en testículos. También, se encuentra

peritonitis fibrinosa, perihepatitis, pericarditis, granulomas caseosos en pulmones y

sacos aéreos, o articulaciones con exudado (Shivaprasad, 2000; Swayne, 2013).

La histopatología se caracteriza por congestión vascular severa en hígado, bazo y

riñones. Se puede ver necrosis multifocal de hepatocitos con infiltrado de heterófilos y

fibrina en parénquima. En general, se observa congestión en los órganos afectados, y

las lesiones nodulares corresponden a necrosis con infiltrado heterofílico y fibrina. En

corazón, se ve necrosis con infiltrado de heterófilos, linfocitos y plasmocitos. En ovario

y testículos, las lesiones se corresponden con inflamación fibrinosupurativa a

piogranulomatosa (Shivaprasad, 2000; Swayne, 2013).

Por su parte, las enfermedades paratíficas, al provocar rápida septicemia en pollitos

recién nacidos, no muestran lesiones aparentes. Sin embargo, cuando el curso se

prolonga más allá de 4 días, se puede observar enteritis severa con lesiones de

necrosis focal en intestino delgado, y hepato y esplenomegalia con congestión,

hemorragias o focos de necrosis. También, aunque con menor frecuencia, puede verse

renomegalia con congestión, perihepatitis y pericarditis fibrinopurulentas, restos de

yema sin absorber, peritonitis, neumonía, artritis purulenta, poliserositis, hipopión,

panolftalmitis, aerosaculitis, onfalitis, y reducción de la ganancia de peso. En ovarios y

oviductos se observó procesos inflamatorios con infiltrado de heterófilos (Gorham

et al., 1994; Swayne, 2013).

La Salmonella Enteritidis se adhiere a las células epiteliales y provoca cambios en la

densidad y morfología, alterando la fisiología de la mucosa intestinal, provocando

diarreas. Histopatológicamente se observa inflamación de epitelio y lámina propia de

ciegos y colon, con infiltrado heterofílico (Swayne, 2013).

49

Figura II.15. Serosa duodenal de pollito de 14 días de vida infectado con

Salmonella Enteritidis al 1° día de vida. Se observa moderadamente engrosada

con macrófagos, heterófilos y fibrina. Tinción de hematoxilina-eosina; barra=250

µm (Gorham et al., 1994).

DIAGNÓSTICO

El diagnóstico de laboratorio, especialmente en infecciones paratíficas, suele realizarse

por cultivo de materias fecales. En infección por S. Pullorum y S. Gallinarum, es posible

el diagnóstico serológico para individualizar y eliminar los portadores. Como prueba

tamiz, el antígeno de S. Pullorum puede servir también en la detección de anticuerpos

para el lipopolisacárido de S. Enteritidis en pollos (Acha y Szyfres, 2001).

El diagnóstico de S. Pullorum y S. Gallinarum se basa en la aparición de aves muertas, y

el aislamiento e identificación de la cepa actuante, teniendo en cuenta una buena

anamnesis —historia del lote, signología, mortalidad, lesiones (Barrow y Freitas Neto,

2011). Los principales órganos para cultivo son hígado, bazo, ciegos y médula ósea.

También se podrían realizar hisopados cloacales, aunque no representa una prueba

muy eficiente para estos serotipos. En medios nutritivos luego de 24 horas de

incubación, las colonias de S. Pullorum son pequeñas, suaves y translúcidas, mientras

que las colonias de S. Gallinarum son suaves, azul-grisáceas, húmedas, circulares y

50

enteras. La diferenciación más específica se realiza a través de estudios de PCR y ELISA

(Shivaprasad, 2000; Barrow y Freitas Neto, 2011; Swayne, 2013).

Para las enfermedades paratíficas, las observaciones clínicas pueden constituir un

buen camino hacia el diagnóstico, pero la definición del mismo debe realizarse a través

de aislamiento e identificación de la bacteria. Las pruebas básicas incluyen cultivos y

serología, donde las muestras a cultivar pueden ser de tejidos (hígado, bazo, riñón,

vesícula biliar, ovario, oviducto, testículos, saco vitelino, corazón, sangre del corazón),

huevos, heces o ambientales; las muestras intestinales (íleon, ciegos y tonsilas cecales)

son las más importantes. También, se pueden realizar hisopados cloacales. Mediante

métodos de cultivo estándar, se pueden obtener colonias para caracterización

bioquímica y serológica. Los análisis específicos rápidos incluyen pruebas de ELISA, en

búsqueda de anticuerpos específicos, pruebas de aglutinación, y distintos tipos de PCR,

en búsqueda de segmentos de ADN (Leedom Larson y Spickler, 2013; Swayne, 2013).

En la vigilancia del procesamiento de alimentos, se realiza un muestreo por cultivo del

producto en las diferentes etapas de elaboración, así como de los utensilios y

superficies que entran en contacto con el alimento (Acha y Szyfres, 2001).

CONTROL Y PREVENCIÓN

Ya que las gallinas son reservorios de Salmonella, todo programa de control y

prevención deberá comenzar desde la incubadora (Akpabio, 2015). Entender las

relaciones entre los distintos serotipos es de suma importancia en el diseño y

realización de dichos programas (Chacana y Terzolo, 2006). El mayor esfuerzo debe

realizarse para erradicar la infección de la granja, dejando el tratamiento como última

opción (Shivaprasad, 2000), y en evitar que Salmonella ingrese a la cadena de

alimento, protegiendo al ser humano de la infección (Acha y Szyfres, 2001).

Cuando la enfermedad se presenta en la granja, el tratamiento será acorde a la

presentación clínica observada. En casos no complicados, no se debe realizar

tratamiento antibiótico, ya que esto podría llevar a un efecto sobre la microbiota

normal que permitiría a la Salmonella re-establecerse, favoreciendo su persistencia y

51

aumentando el riesgo de desarrollo de resistencia antibiótica. Por esto, se deberá

centrar el tratamiento en terapias de soporte, con reposición de fluidos y corrección

electrolítica (Leedom Larson y Spickler, 2013). En cambio, para los casos septicémicos,

se puede utilizar diversos antibióticos, cuya selección dependerá de la realización de

aislamiento y antibiograma de la cepa actuante. Además, se pueden brindar

antiinflamatorios esteroideos para reducir los efectos endotoxémicos, y suero con

anticuerpos específicos para LPS de Salmonella (Leedom Larson y Spickler, 2013). Las

sulfonamidas —e.g. sulfadiazina, sulfamerazina, sulfatiol, sulfametazina,

sulfaquinoxalina—, los nitrofuranos, cloranfenicol, tetraciclinas y aminoglucósidos son

capaces de reducir la mortalidad en pullorosis y tifosis, pero no todos están permitidos

en todos los países y ninguno es capaz de eliminar la infección de la granja, incluso

quedando aves portadoras. Los huevos pueden ser sometidos a una aspersión de

sulfato de neomicina (Shivaprasad, 2000; Swayne, 2013). Otra opción es la

administración de antibiótico seguida de probiótico (Swayne, 2013). En todo caso,

deberá respetar el tiempo de retirada indicado por el fabricante.

El uso excesivo de los antibióticos llevó a la aparición de resistencia a estos. Por

ejemplo, se citan resistencias de S. Gallinarum a furazolidona, fluorquinolonas —

enrofloxacina y ofloxacina—, ampicilina, gentamicina y kanamicina, entre otros. A su

vez, la frecuencia de aparición de multiresistencia ha aumentado, teniendo la

antibioticoterapia un efecto selectivo sobre otras especies bacterianas presentes en el

animal. Este desarrollo de resistencia también implica un riesgo para la salud pública,

ya que es posible la transmisión de bacterias resistentes al humano (Tollefson y Miller,

2000; Barrow y Freitas Neto, 2011; Swayne, 2013). Sin embargo, no es recomendable

el tratamiento antibiótico de lotes positivos (Leedom Larson y Spickler, 2013), y en

muchos países ya no se basa en antibioticoterapia (Swayne, 2013). Otros tratamientos

podrían incluir la utilización de probiótico, o incluso vacunaciones para reducir la

susceptibilidad (Akpabio, 2015).

Para controlar la infección, se deben efectuar un protocolo que abarque distintos

puntos e incluya: examinación serológica y bacteriológica de reproductores, posterior

eliminación de los portadores y control repetitivo de los tratados; limpieza y

desinfección de los galpones e instalaciones; control de insectos y roedores, con

52

controles periódicos; fortalecimiento de las medidas de bioseguridad, con acceso

restringido al personal y equipo autorizado; obtención de huevos, pollitos o adultos de

granjas libres con estrictos estándares de sanitización, con aislamiento/cuarentena;

desinfección de huevos incubando; brindar alimentos peletizado sin proteína de origen

animal, con control bacteriológico; y otras medidas tales como la inspección

veterinaria en frigorífico, la educación de los manipuladores de alimentos y la vigilancia

epidemiológica de las autoridades de salud (Acha y Szyfres, 2001; Akpabio, 2015). El

reemplazo de los lotes puede resultar en costos excesivos; por esto, los países

desarrollados centran el esfuerzo económico en los programas de vigilancia

(Shivaprasad, 2000).

El control de estas infecciones dependerá del nivel de infección en la región. Así,

cuando el nivel es bajo o donde se contempla la erradicación, se podrían utilizar

pruebas serológicas y eliminación de aves positivas. En lugares donde el nivel de

infección es alto o no se contemple la erradicación, se considera que el uso de vacunas

es la medida adecuada (Barrow y Freitas Neto, 2011). Existen distintos tipos de

vacunas probadas (vivas, atenuadas o inactivadas) cada una con sus beneficios y sus

desventajas. Incluso, vacunas vivas administradas vía oral demostraron inducir

resistencia del intestino a ser colonizado, a través de competición exclusiva (Chacana y

Terzolo, 2006; Barrow y Freitas Neto, 2011). Las vacunas pueden prevenir la

enfermedad, al reducir la colonización y su diseminación, pero no la infección ni

portación de la bacteria, y no necesariamente confieren protección contra serotipos

heterólogos (Acha y Szyfres, 2001; Leedom Larson y Spickler, 2013; Swayne, 2013). La

vacunación y los probióticos son más eficientes en programas de reducción de riesgos

(Swayne, 2013).

Entre las medidas preventivas encontramos un conjunto que abarca diversas

estaciones de la línea productiva: asegurar la bioseguridad en la granja; comprar

individuos o huevos de granjas libres y aislamiento de los recién adquiridos; no mezclar

animales de distinto origen; realizar prácticas de "todo dentro, todo fuera"; controlar

roedores e insectos; cambiar el alimento, y controlarlo bacteriológicamente; utilizar

suplementación alimenticia (prebióticos, probióticos, etc.); brindar agua potable

clorada; mantener buena higiene en instalaciones, equipos y personal; evitar o reducir

53

los eventos estresantes (Shivaprasad, 2000; Leedom Larson y Spickler, 2013; Swayne,

2013).

Los pollitos son muy susceptibles a infecciones con Salmonella, pero el establecimiento

de la microbiota intestinal aumenta su resistencia. Esto justifica la utilización de

probióticos como fuente de microorganismos de competición exclusiva, disminuyendo

la colonización intestinal y la invasión interna por Salmonella, reduciendo así la

incidencia. Bacterias de los géneros Lactobacillus, Bifidobacterium, Bacillus,

Escherichia, Pediococcus y Streptococcus, y levaduras Saccharomyces han demostrado

actividad protectora contra Salmonella en pollitos; posiblemente, mezclas definidas de

estos microorganismos lograrían mejores resultados (Barrow y Freitas Neto, 2011;

Swayne, 2013). La microbiota intestinal resultante inducirá una respuesta inflamatoria

superior, mejorando la resistencia a infección por Salmonella (Crhanova et al., 2011).

Otras alternativas de enfoque biológico son la utilización de aditivos prebióticos, que

favorecen el crecimiento de la microbiota, mejorando la protección, y la de ácidos

orgánicos (Swayne, 2013). Sin embargo, los tratamientos que involucran una alteración

de la microbiota intestinal pueden derivar en un aumento o en una reducción de la

colonización por parte de los patógenos (Holt y Porter Jr., 1992).

54

III. MATERIALES Y MÉTODOS

APROBACIÓN DEL CICUAE

Los ensayos llevados a cabo durante el período de residencia (Marzo-Junio 2017)

contaron con el aval del Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales de

Experimentación del Centro Regional Buenos Aires Sur del INTA (CICUAE INTA

CeRBAS), registrado en el Dictamen 104/2017 del 14 de Febrero del 2017.

ANIMALES

Para el presente estudio, se realizó un ensayo aleatorizado donde se trabajó con 149

pollitos bb de línea genética Cobb®, de 1 día de vida, provenientes de un lote con

antecedentes de Salmonella spp.

INSTALACIONES

Las aves fueron alojadas en un galpón cerrado, donde se las mantuvo en jaulas de

metal de dos módulos. Se las alimentó con comederos tipo oval hasta la semana de

vida, continuando con canaleta, y el agua fue dada a través de bebederos manuales de

5 litros. Se utilizó un alimento balanceado iniciador de Agropecuaria La Candelaria S.A.,

libre de materias primas de origen animal y sin aditivos antibióticos ni

coccidiostatos/coccidicidas, siendo brindado ad libitum. Para el agua de bebida se

utilizó agua mineral comercial. La partida de alimento fue analizada

bacteriológicamente para ratificar la ausencia de Salmonella spp.

Recibieron 24 horas de luz durante el primer día. Al segundo día, se comenzó con el

programa de luz, siendo de 14 horas de luz (de 6:00 a 20:00 horas) y 10 horas de

oscuridad. El ambiente también contó con calefacción, la cual se mantuvo en 25±1°C, y

con ventilación utilizada a necesidad según el estado ambiental y de los animales

mismos.

55

TRATAMIENTOS

En el presente ensayo, se realizó la inoculación oral de Lactobacillus reuteri cepa MCY

(Alonso et al., 2015; Garcia Franco, Alonso y García, 2016) como probiótico. El diseño

experimental utilizado fue enteramente aleatorizado en un esquema factorial 1 x 3 + 1,

constituyéndose de una fuente de probiótico (Lactobacillus reuteri), tres tratamientos

(tres dosis diarias más tres dosis en una semana individuales; tres dosis diarias

individuales; tres dosis en agua de bebida) y un control (sin probiótico).

La Tabla III.1 presenta resumidamente los programas de administración utilizados. El

primero incluye una dosificación individual por vía ingluvial de 0,2 ml de caldo MRS con

Lactobacillus reuteri cepa MCY (Alonso et al., 2015; Garcia Franco, Alonso y García,

2016) durante los tres primeros días, para luego proseguir con dosificaciones al día 5, 7

y 9. El segundo programa incluyó sólo la dosificación individual vía ingluvial durante los

tres primeros días de vida. Para la administración ingluvial se utilizó una cánula de

plástico de 5 cm de largo y 2 mm de diámetro, acoplada a una jeringa de 2 ml, la cual

fue introducida por cavidad oral y desplazada hacia caudal con inclinación hacia la

derecha del animal. El tercer programa fue llevado a cabo mediante el agua de bebida

durante los primeros tres días de vida, habiéndose dosificado 20 ml de caldo en 700 ml

de agua mineral diariamente.

Grupo Jaula n Dosis Inoculación

T1 1 18

0,2 ml IG

Días 1-3, 5, 7, 9 2 9

T2 3 18

Días 1-3 4 9

T3

R1 5 19

20 ml/700 ml agua

Días 1-3 R2 6 19

R3 7 19

R4 8 8

C 9 15

NO NO 10 15

Total - 149 - -

Tabla III.1. Esquema de inoculación con Lactobacillus reuteri cepa MCY. (T)

tratamiento; (R) réplica; (IG) vía ingluvial.

56

PREPARACIÓN DEL PROBIÓTICO

Se utilizó Lactobacillus reuteri cepa MCY proveniente del cepario del Laboratorio de

Nutrición Animal, FCV, UNICEN. La cepa corresponde a la especie Lactobacillus reuteri

aislada a partir de muestras de pollos parrilleros e identificada mediante kits

bioquímicos y PCR. Esta cepa mostró eficacia en desafíos in vitro contra Salmonella

Enteritidis y S. Gallinarum (Alonso et al., 2015; Garcia Franco, Alonso y García, 2016).

Dos cultivos en placas de agar MRS fueron recibidos en el Laboratorio de Bacteriología

de INTA EEA Balcarce, con anterioridad al inicio del ensayo, a partir de cuales se

realizaron repiques consecutivos en agar MRS, incubados en jarra de anaerobiosis a

37°C por 48 horas, con la finalidad de comprobar la pureza de la cepa y probar el

correcto crecimiento en el medio.

Utilizando los repiques más recientes, se conformaron alícuotas para la conservación

de la cepa. Se tomó una colonia y se sembró en 700µL de caldo MRS en un Eppendorf,

y se incubó en jarra de anaerobiosis a 37°C por 48 horas. Luego, se agregaron 300µL de

glicerol y se almacenó en freezer a -70°C.

La preparación del inóculo a administrar se realizó utilizando caldo MRS. En un tubo

con 5 ml de caldo MRS, se inocularon 100µL de la alícuota previamente descongelada y

homogeneizada y se incubó en estufa a 37°C. A la par, se incubó un tubo con 5 ml de

caldo MRS como control. Luego de 3 horas, se sembró una placa de MRS con el inóculo

en tubo, para control, y se pasó el inóculo en tubo a un frasco con c.s.p. 300ml de

caldo MRS, el cual se incubó por 48 horas a 37°C.

A cada inóculo se le realizó un recuento bacteriano inmediatamente antes de ser

utilizado mediante el método de microgotas (Miles et al., 1938). La siembra se realizó

por triplicado en agar MRS y una de agar ASC. Luego de una incubación en jarra de

anaerobiosis a 37°C por 48 horas, se realizó el recuento de colonias en las placas,

eligiendo la dilución en la cual se distinguieran visualmente colonias separadas en un

número de 5-30 colonias. Se calculó el promedio de colonias en las 4 placas, se

multiplicó por el exponente de dilución, y se realizó la conversión a ml, expresando el

resultado como UFC/ml.

57

Figura III.1. Recuento bacteriano mediante el método de microgotas sobre agar

según Miles et al. (1938). A la derecha, se observa una ilustración donde se

muestra la forma de disponer las microgotas de las diluciones a evaluar; en este

trabajo se utilizó hasta una dilución de 10-8. Se observa, a la izquierda, una

fotografía de una placa de agar MRS con colonias de Lactobacillus reuteri y, a la

derecha, un esquema de la ubicación de las diluciones.

PRUEBAS BACTERIOLÓGICAS COMPLEMENTARIAS

Para el alimento, se realizó un análisis bacteriológico de la partida para verificar la

ausencia de Salmonella spp., cuya presencia podría afectar los resultados del ensayo.

Este análisis se realizó mediante cultivo en caldo lactosado como medio de pre-

enriquecimiento (Pascual Anderson y Calderón y Pascual, 2000), para luego realizar

subcultivos en caldo tetrationato —selectivo para Salmonella— (Tate et al., 1990),

seguido de repique en placas de agar MacConkey y XLD. Se consideró una muestra

negativa a Salmonella spp. si los tres repiques resultaban negativos.

Los animales fueron sometidos, desde el primer día, a pruebas bacteriológicas con el

objetivo de controlarlos en el tiempo. A todos los pollitos se les realizó extracción de

meconio para examen bacteriológico el mismo día de ingreso (1 día de vida), con el

objetivo de evaluar la presencia/ausencia de Salmonella spp. en el tracto digestivo.

Esta técnica implica tomar a cada pollito con una mano y comprimir suavemente, con

los dedos pulgar y mayor, en la zona abdominal superior hasta la expulsión de meconio

por la cloaca. El pool de meconio fue recolectado en un recipiente estéril, se cultivó en

58

caldo tetrationato por 48 horas a 37°C, y luego se realizaron repiques en medio agar

MacConkey y XLD, colocándolos en estufa a 37°C. A las 24 horas, se realizó la

evaluación de los repiques y se realizaron otros dos repiques de meconio con distancia

de 48 horas, con sus respectivas evaluaciones a las 24 horas. Para este ensayo, los

cultivos fueron utilizados como confirmación de la presencia de Salmonella spp. en el

lote.

También, los pollitos fueron sometidos a hisopado cloacal con el objetivo de evaluar la

presencia y excreción de Salmonella spp. Esto se llevó a cabo el día 6 de vida, siendo

un muestreo de 3 animales por jaula. La técnica consistió en introducir un hisopo de

algodón estéril a través de la cloaca del individuo y, realizando movimientos circulares,

recolectar materia fecal directamente del colon. Los hisopos se colocaron en pool en

frasco de 200 ml de caldo tetrationato, que se incubó en estufa a 37°C por 48 horas,

con un posterior repique en XLD incubado a 37°C por 48 horas.

Otras pruebas incluyeron muestras de hígado, bazo, ciego y tonsilas cecales de todos

los pollitos al momento de la eutanasia (12 días de vida). En el caso de hígado y bazo,

se tomó una porción de 0,5-1 cm de estos y se colocó cada uno en un tubo con 3 ml de

caldo cerebro-corazón, se incubó a 37°C por 24 horas, y se repicó en tubos de caldo

tetrationato. Para ciego y tonsilas cecales, se tomó una muestra de 0,5-1 cm del ápice

de un ciego y una de la porción de tonsilas cecales, que se colocaron separadas en

tubos con 3 ml de caldo tetrationato que se incubaron en estufa a 37°C por 48 horas.

Luego, todas las muestras en caldo tetrationato se repicaron en XLD y fueron

evaluadas a las 48 horas.

Con el fin de confirmar presencia de Salmonella spp. infectante, se realizaron pruebas

bioquímicas —agar hierro de Kligler, ONPG, LIA y nitrato— y un análisis serológico para

los serotipos patógenos más comunes —S. Gallinarum, S. Enteritidis, S. Typhimurium—

mediante aglutinación en tubo.

59

MUESTREO HISTOLÓGICO

Se realizó eutanasia a los 12 días de vida, mediante decapitación (AVMA, 2013; CICUAE

INTA CeRBAS, 2017), con un corte preciso, con sección completa de la médula espinal,

lo cual asegura una pérdida inmediata de la conciencia sin percepción de dolor (van

Rijn et al., 2011).

Con 4 tratamientos, 6 aves/tratamiento para T1, T2 y TC y 4 aves/repetición para T3, se

totalizaron 30 animales experimentales para el análisis de histomorfometría de la

mucosa intestinal.

Durante la necropsia, con la ayuda de una pinza diente de ratón y una tijera, se

procedió a seccionar una porción de duodeno, siendo el sector de la flexura el

seleccionado para el tipo de análisis posterior. La muestra fue abierta

longitudinalmente por la curvatura mesentérica del asa, lavada con PBS, colocada en

un cassette histológico y preservada en recipientes estériles con formol al 10%

(formaldehído 40%:agua destilada, en relación 1:9) por 48 horas, lo cual favorece el

procesado posterior (Martoja y Martoja-Pierson, 1970). Transcurrido el tiempo, se

realizó el cambio de formol por alcohol al 70%, y se transportaron las muestras al

Laboratorio de Histología de la FCV, UNICEN, donde se guardaron hasta su procesado.

En el Laboratorio de Histología, se llevó a cabo el procedimiento de inclusión de las

muestras y obtención de los cortes histológicos a analizar (ver Figura III.2). Los pasos

del procesamiento de inclusión fueron:

- Alcohol 80° 1 baño 1 hora

- Alcohol 96° 3 baños 1 hora c/u

- Alcohol Butílico 3 baños 1 hora c/u

- Parafina + Alcohol Butílico 1 baño Toda la noche Estufa 58°C

- Parafina 1 baño 2 horas Estufa 58°C

- Parafina 1 baño 1 ½ hora Estufa 58°C

- Parafina 1 baño 1 ½ hora Estufa 58°C

60

- Armado del taco

Teniendo el taco, se procedió a realizar cortes histológicos seriados de 5 µm mediante

un micrótomo Microm HM 315, utilizando cuchillas Feather Microtome Blade R35. Los

cortes fueron montados en portaobjetos y secados en estufa a 36°C por 24 horas.

Luego, se realizó la tinción de los mismos con hematoxilina-eosina.

Figura III.2. Secuencia de pasos del procesado histológico de rutina. Se observan

los pasos desde la toma de muestra hasta la obtención del corte histológico

montado en el portaobjeto. Al. alcohol etílico; But. alcohol butílico; But+P. mezcla

1:1 de butilo:parafina; P. parafina.

61

Figura III.3. Fotografías del cortado de una muestra de duodeno incluida en

parafina. a. Cortado en micrótomo; b. corte en baño maría; c. cortes montados en

portaobjetos antes de introducirlos en estufa para su secado.

TINCIÓN HISTOLÓGICA

La técnica de tinción con hematoxilina-eosina es la técnica de elección para la

evaluación de la histoarquitectura de un corte histológico. La hematoxilina es un

colorante básico que se une a núcleos y ADN, y la Eosina es un colorante ácido que se

une al citoplasma. Así, los núcleos se tiñen de color azul mientras que el citoplasma y la

matriz extracelular se tiñen de tonalidades variables de rosas (Martoja y Martoja-

Pierson, 1970; Fischer et al., 2008). Los reactivos utilizados fueron:

- Hematoxilina s/Gill (III) modificada (Solución), Biopack®;

- Eosina Amarillenta (Solución al 0,5% P/V ), Biopack®.

La técnica consistió en los siguientes pasos:

- Desparafinado: incluye dos baños de 10 minutos en xileno, seguidos de cuatro

baños en alcoholes de graduación descendente de 2 minutos cada uno (dos

baños en 96°, uno en 80° y uno en 70°) e hidratación en agua destilada por 2

minutos dos veces.

- Tinción nuclear con hematoxilina durante 5 minutos.

- Enjuague con agua corriente.

- Enjuague con agua destilada.

a. b. c.

62

- Tinción citoplasmática con eosina durante 30 segundos.

- Enjuague con agua corriente.

- Enjuague con agua destilada.

- Secado en estufa a 30-35ºC durante 24 horas o en estufa a 60°C durante 5-10

minutos.

- Montado con cubre-objeto utilizando medio de montaje.

Una vez montados, los cortes se dejaron secar, para luego ser observados al

microscopio.

Figura III.4. Cortes histológicos de duodeno de pollitos en estudio. Se puede

visualizar cómo quedan los cortes luego de la tinción con hematoxilina-eosina.

CAPTURA DE IMÁGENES

Una vez secos, se procedió a la captura de microfotografías digitales de los cortes con

un microscopio Leica DM500 con cámara Leica ICC50 W incorporada (Leica

Microsystems), a una magnificación de 4x y 10x, para las vellosidades y las criptas

respectivamente. Se utilizó el programa LAS EZ 3.3.0 (Leica Microsystems, Suiza, 2016)

con la siguiente configuración:

63

- Ajuste de blancos Automático

- Ajustes de exposición

o Brillo 60%

o Saturación 50,00

o Gamma 5,00

- Formato de archivo TIFF

- Dimensiones de imagen 5 megapíxeles (2592 x 1944 px)

ANÁLISIS HISTOMORFOMÉTRICO

Las imágenes fueron analizadas mediante el software de código abierto ImageJ

(Schindelin et al., 2015), habiéndose evaluado:

- Altura de vellosidades: Mediante el trazado de una línea recta o partida, se

midió la distancia desde la base de la vellosidad hasta el ápice. Se tomaron 50

mediciones por grupo.

- Profundidad de criptas: Definida como la profundidad de la invaginación entre

vellosidades, se midió desde la desembocadura hacia el lumen intestinal hasta

la base de la cripta, en proximidad de la muscular de la mucosa. Se tomaron

100 mediciones por grupo.

- Relación Vellosidades:Criptas: Se realizó un análisis de relación entre la media

de la altura de vellosidades y la media de profundidad de criptas.

Se realizó un análisis cualitativo sobre las características presentadas por la mucosa

intestinal. Las dimensiones analizadas fueron:

- Integridad de la mucosa, considerando integridad del epitelio y otras

alteraciones histomorfológicas de vellosidades;

64

- Intensidad del infiltrado inflamatorio, incluyendo presencia de leucocitos

intraepiteliales e infiltrados en la lámina propia.

Para evaluar las características cualitativas, se consideró una escala de cuatro grados:

- Grado 0 = sin alteraciones —i.e. mucosa criptas y vellosidades de morfología

normal, con el epitelio completo, y escasos linfocitos intraepiteliales;

- Grado 1 = alteraciones leves —i.e. vellosidades con morfología normal pero con

el epitelio alterado y/o desprendido hacia el extremo, e infiltrado linfocitario

leve, en epitelio y/o en lámina propia;

- Grado 2 = alteraciones moderadas —i.e. vellosidades con morfología alterada

pero aún identificable, e infiltrado moderado intraepitelial y en lámina propia;

- Grado 3 = alteraciones severas —i.e. vellosidades con severas alteraciones,

perdiendo su histomorfología clásica, y severo infiltrado linfocitario.

ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Para evaluar las diferencias en altura de vellosidades y en profundidad de criptas entre

tratamientos, se realizó análisis de varianza (ANOVA), donde las unidades de análisis

fueron los individuos, por lo cual se trabajó con el tamaño medio de las vellosidades y

criptas de cada uno. La normalidad de los residuos se analizó mediante el test Shapiro-

Wilk y la homogeneidad de varianzas mediante el test de Levene.

65

IV. RESULTADOS

RECUENTO BACTERIANO DEL INÓCULO PROBIÓTICO

Los resultados de los recuentos bacterianos de los inóculos de Lactobacillus reuteri se

presentan en la Tabla IV.1. Se observó que los recuentos permanecían constantes en

una potencia de 107, con un promedio de 6,54 ± 2,51 x 107 UFC/ml. Es de destacar que

en el recuento del inóculo Lb 2 existió un valor muy por encima de lo esperado y

observado al resto de los inóculos, por lo que se estima que existió alguna falla en la

realización de la técnica. Por esto, el promedio y SD fueron calculados sin tener en

cuenta Lb 2.

Recuento Bacteriano de Inóculos UFC/ml

Lb 1 6,6 x 107

Lb 2 1,8 x 109

Lb 3 3,8 x 107

Lb 4 4,4 x 107

Lb 5 8,1 x 107

Lb 6 9,8 x 107

Media ± SD 6,54 ± 2,51 x 107

Tabla IV.1. Recuento bacteriano de los inóculos de Lactobacillus reuteri. Mediante

la técnica de recuento bacteriano en placa (Miles et al., 1938) se estimó la

cantidad de UFC por mililitro de inóculo de caldo MRS. () Lb2 no se tuvo en

cuenta para el cálculo de la media.

OBSERVACIONES MACROSCÓPICAS

Durante la necropsia, al momento de tomar la muestra de duodeno, la inspección del

mismo no demostró alteraciones macroscópicas. Tampoco fueron observadas otras

lesiones sistémicas características de infecciones por Salmonella, como lo serían

nódulos o congestión en distintos órganos—e.g. corazón, hígado, bazo. Sin embargo,

se observaron algunas alteraciones en ciegos de los tratamientos 2 y 3 y grupo control.

En el Tratamiento 2, se observó algunos ciegos con contenido oscuro; en el

66

Tratamiento 3 y el Grupo Control, se observaron ciegos oscuros con gas en la mayoría

de los animales. A pesar de estas observaciones, no se realizó el análisis

histopatológico de estos órganos, ya que no se contemplaba en los objetivos.

HISTOMORFOMETRÍA Y LESIONES MICROSCÓPICAS

En cuanto a la altura de vellosidades, no se observaron diferencias significativas de los

valores histomorfométricos entre el Grupo Control y los tres grupos de tratamiento

probiótico (P > 0,05). Como detalle, se puede señalar que el Tratamiento 2 presentó

las vellosidades de menor altura y el Tratamiento 3 las de mayor.

T1 T2 T3 C

n 5 6 12 5

Med

ia d

e al

tura

de

vello

sid

ades

po

r in

div

idu

o

(mm

)

0,854 0,612 1,059 0,855

0,695 1,227 0,875 0,879

0,929 0,755 0,969 0,816

1,015 0,734 1,187 1,359

1,093 0,596 1,081 1,009

0,989 1,001

1,239

1,106

0,958

0,817

0,978

0,846

Media 0,917 0,819 1,010 0,983

SD 0,153 0,245 0,131 0,222

Tabla IV.2. Conjunto de datos sobre altura de vellosidades duodenales analizados.

Estos provienen de las medias de las alturas de vellosidades de cada individuo, y

las medias y desvío estándar de cada grupo en estudio, expresadas en mm.

67

Gráfico IV.1. Altura de vellosidades por grupo. Se observa la media y el desvío

estándar de la altura de vellosidades.

El análisis del gráfico permite inferir la inexistencia de diferencias significativas entre

los distintos grupos en ensayo. La corroboración de esto se realizó mediante un análisis

de varianza (ANOVA), donde se obtuvo un p valor de 0,214 (p > 0,05), por lo cual se

infiere que no se presentaron diferencias entre los tratamientos.

Fuente g.l. Suma de

cuadrados Media

cuadrática Razón/

Prueba f p valor

(> f)

Tratamiento 3 0,1564 0,05213 1,608 0,214

Residuos 24 0,7782 0,03242

Tabla IV.3. Resultados del test de ANOVA para altura de vellosidades.

Por su parte el test de Shapiro-Wilk expresó un p valor de 0,098, por lo que los

residuos de ANOVA se consideraron normales. El test de Levene dio un p valor de

0,306, aceptándose la homogeneidad de las varianzas. Las salidas de ambos test se

presentan a continuación:

Test de normalidad de Shapiro-Wilk:

data: AnovaModel.1$residuals

W = 0.93795 p-value = 0.09803

68

Test de homogeneidad de varianzas de Levene (centro = "media")

Df F value Pr(>F)

Group 3 1.2725 0.3062

Habiéndose confirmado los supuestos de ANOVA y dado que p = 0,214, se concluye

que no existieron diferencias significativas entre los cuatro grupos del presente ensayo

(p > 0,05).

Por su parte, para las criptas de Lieberkühn, no se observaron diferencias significativas

de los valores histomorfométricos entre el Grupo Control y los tres grupos de

tratamiento probiótico (P > 0,05). Como detalle, se puede señalar que el Grupo

Control presentó las criptas más profundas y el Tratamiento 2 las de menor

profundidad.

T1 T2 T3 C

n 6 6 12 5

Med

ia d

e p

rofu

nd

idad

de

cri

pta

s p

or

ind

ivid

uo

(mm

)

0,203 0,169 0,186 0,172

0,194 0,188 0,218 0,226

0,192 0,147 0,182 0,199

0,207 0,168 0,184 0,213

0,162 0,163 0,219 0,182

0,162 0,176 0,195

0,209

0,171

0,176

0,165

0,214

0,197

Media 0,187 0,169 0,193 0,198

SD 0,020 0,014 0,019 0,022

Tabla IV.4. Conjunto de datos sobre profundidad de criptas de Lieberkühn

analizados. Estos provienen de las medias de las profundidades de las criptas de

Lieberkühn de cada individuo, y las medias y desvío estándar de cada grupo (mm).

69

Gráfico IV.2. Profundidad de criptas de Lieberkühn por grupo. Se observa la media

y el desvío estándar de la profundidad de criptas de Lieberkühn.

El análisis del gráfico permite inferir la inexistencia de diferencias significativas entre

los distintos grupos en ensayo, lo cual se corroboró mediante ANOVA, donde se

obtuvo un p valor de 0,0517 (p > 0,05), por lo cual se deduce que no se presentaron

diferencias entre los tratamientos.

Fuente g.l. Suma de

cuadrados Media

cuadrática Razón/

Prueba f p valor

(> f)

Tratamiento 3 0,003081 0,0010270 2,959 0,0517

Residuos 25 0,008678 0,0003471

Tabla IV.5. Resultados del test de ANOVA para profundidad de criptas de

Lieberkühn.

Por su parte, el test de Shapiro-Wilk expresó un p valor de 0,1183, por lo cual los

residuos de ANOVA se consideraron normales, y el test de Levene dio un p valor de

0,4448, aceptándose la homogeneidad de las varianzas. Las salidas de ambos test se

presentan a continuación:

Test de normalidad de Shapiro-Wilk:

data: AnovaModel.2$residuals

W = 0.94274 p-value = 0. 1183

70

Test de homogeneidad de varianzas de Levene (centro = "media")

Df F value Pr(>F)

Group 3 0.9214 0.4448

Ambos supuestos se cumplen, por lo que se aceptaría lo obtenido en el test de ANOVA

y se concluiría que no hubo diferencias significativas entre los grupos del ensayo (p >

0,05). Sin embargo, ya que el p valor es cercano a 0,05, se añadió un paso y se realizó

un test de comparaciones múltiples de Tukey (Tabla IV.6.), mediante el cual se pudo

concluir que no existen diferencias significativas entre los distintos tratamientos del

ensayo (p > 0,05).

Estimado Error

Estándar (SE) t valor P valor(> |t|)

T1 – C = 0 -0.011640 0.011282 -1.032 0.7304

T2 – C = 0 -0.029620 0.011282 -2.625 0.0646

T3 – C = 0 -0.005256 0.009917 -0.530 0.9504

T2 – T1 = 0 -0.017980 0.010757 -1.671 0.3566

T3 – T1 = 0 0.006384 0.009316 0.685 0.9007

T3 – T2 = 0 0.024364 0.009316 2.615 0.0655

Signif. codes: 0 '***' 0.001 '**' 0.01 '*' 0.05 '.' 0.1 ' ' 1 (Adjusted p values reported -- single-step method)

Tabla IV.6. Resultados del test de comparaciones múltiples de Tukey para

profundidad de criptas de Lieberkühn.

Al realizar un análisis de ratio entre altura de vellosidades y profundidad de criptas, se

observa que todos los grupos presentaron ratios similares cercanos a 5, viéndose un

ratio levemente mayor en el Tratamiento 3.

71

Grupo Altura de vellosidades Profundidad de criptas

Ratio n Media ± SD (mm) n Media ± SD (mm)

T1 5 0,917 5 0,187 4,91 5:1

T2 5 0,819 6 0,169 4,85 34:7

T3 6 1,009 6 0,193 5,23 47:9

Control 12 0,983 12 0,198 4,96 5:1

Tabla IV.7. Razón de las medidas histomorfométricas de vellosidades y criptas de

Lieberkühn. Resultados obtenidos del análisis de altura de vellosidades y

profundidad de criptas de Lieberkühn, expresándose media en milímetros.

En cuanto a observaciones cualitativas microscópicas, se realizó una evaluación de la

integridad de la mucosa, y de la presencia de infiltrado linfocitario en epitelio y lámina

propia (Figura IV.1). La integridad de la mucosa se vio afectada en la mayoría de las

muestras, notándose desprendimiento y pérdida de epitelio, ya sea sólo hacia las

puntas de las vellosidades (grado 1-leve) como en gran parte de estas (grado 2-

moderado y grado 3-severo), destacándose el Grupo Control con un 80% con grado 2.

En la mayoría de los animales, las puntas de las vellosidades se vieron afectadas.

Además, una muestra del Tratamiento 2 y una del 3 presentaron afecciones severas,

donde se observó destrucción de las vellosidades formando masas hacia la luz

intestinal (grado 3-severo), pero sin lesiones en el resto de la pared intestinal. Cabe

resaltar la ausencia de muestras con la mucosa totalmente sana.

Tabla IV.8. Integridad de la mucosa duodenal. Se presentan los resultados de la

evaluación de integridad de mucosa intestinal, en una escala de cuatro grados,

siendo 0 integridad completa y 3 mucosa severamente dañada.

Grupo n INTEGRIDAD DE MUCOSA

0 1 2 3

T1 6 0 0 % 2 33,3 % 4 66,7 % 0 0 %

T2 6 0 0 % 1 16,7 % 4 66,7 % 1 16,7 %

T3 12 0 0 % 5 41,7 % 6 50 % 1 8,3 %

Control 5 0 0 % 1 20 % 3 60 % 1 20 %

72

Gráfico IV.3. Resultados de la evaluación cualitativa de la integridad de mucosa

duodenal. Las barras representan en porcentaje las muestras por tratamiento que

presentaron los distintos grados de alteraciones en mucosa evaluados según la

escala 0-3.

En todas las muestras fue observado infiltrado linfocitario, en mayor o menor medida,

considerando la presencia de linfocitos intraepiteliales y dispersos en la lámina propia.

Se tuvo en cuenta que la presencia de escasos linfocitos, principalmente

intraepiteliales, corresponde a una característica normal del duodeno (grado 0). La

mayoría de las muestras presentaron grado leve de infiltrado (grado 1), indicando la

existencia de una respuesta inflamatoria leve en el duodeno.

Grupo n Infiltrado linfocitario

0 1 2 3

T1 6 2 33,3 % 4 66,7 % 0 0 % 0 0 %

T2 6 2 33,3 % 4 66,7 % 0 0 % 0 0 %

T3 12 1 8,3 % 8 66,7 % 3 25 % 0 0 %

Control 5 2 40 % 3 60 % 0 0 % 0 0 %

Tabla IV.9. Infiltrado linfocitario en mucosa duodenal. Se presentan los resultados

de la evaluación del infiltrado linfocitario en mucosa duodenal, en una escala de

cuatro grados, donde 0 representa la ausencia o escasa presencia de infiltrado y 3

denota un gran infiltrado.

0,0%

20,0%

40,0%

60,0%

80,0%

100,0%

0 1 2 3

T1

T2

T3

Control

73

Gráfico IV.4. Resultados de la evaluación cualitativa del infiltrado linfocitario de

mucosa duodenal. Las barras representan en porcentaje las muestras por

tratamiento que presentaron los distintos grados de infiltrado en mucosa

evaluados según la escala 0-3.

A continuación, se ejemplifican las observaciones microscópicas observadas en algunas

de las muestras evaluadas en la presente tesina (Figura IV.1). En cuanto a la integridad

de las vellosidades, en la mayoría de las muestra se observaron lesiones desde

alteraciones en las puntas hasta pérdida de la histoarquitectura, por lo cual se

ejemplifican los grados 1 a 3 de la escala designada. Para infiltrado, se ejemplifican los

grados 0 a 2, los cuales van de un infiltrado linfocitario normal esencialmente

intraepitelial, a uno moderado de mayor extensión en la mucosa.

0,0%

20,0%

40,0%

60,0%

80,0%

100,0%

0 1 2 3

T1

T2

T3

Control

74

Figura IV.1. Microfotografías de mucosa duodenal de pollitos de 12 días de vida

mostrando lesiones microscópicas. | Arriba- Se muestran los grados de alteración

de la integridad de la mucosa observadas en el presente ensayo (círculo) con una

magnificación de 4x; izquierda- Grado 1 (IM 1), lesión sólo en puntas de las

vellosidades; centro- Grado 2 (IM 2), lesiones de mayor extensión, aún

identificándose vellosidades; derecha- Grado 3 (IM 3), vellosidades destruidas,

conformando masas, aunque no se observó afección de las criptas de Lieberkühn.

| Abajo- se muestran los grados de infiltrado linfocitario (→) observados con una

magnificación de 10x; izquierda- Grado 0 (IL 0), escasos linfocitos, esencialmente

intraepiteliales; centro- Grado 1 (IL 1), infiltrado leve, con linfocitos dispersos en

epitelio y lámina propia; derecha- Grado 2 (IL 2), infiltrado moderado con mayor

cantidad de linfocitos intraepiteliales y acúmulos en lámina propia. Tinción

hematoxilina-eosina.

75

PRUEBAS BACTERIOLÓGICAS COMPLEMENTARIAS

El análisis bacteriológico del alimento presentó resultados negativos en sus tres

repiques consecutivos, por lo que se consideró libre de Salmonella spp.

En los tres repiques en agar XLD realizados a partir de meconio, se observaron colonias

con centro negro, debido a la producción de sulfuro de hidrógeno (SH2), mientras que

en agar MC presentaban morfología pequeña, redonda, con bordes suaves regulares.

Todas estas características son compatibles con Salmonella spp. También, el pool de

hisopados de los pollitos a los 6 días de vida presentó colonias similares en el repique

en agar MC y con centro negro en agar XLD.

Los resultados de las pruebas bioquímicas de las colonias provenientes del meconio se

presentan en la Tabla IV.10. La interpretación de los mismos dieron como resultado

positivo a Salmonella spp. Sin embargo, estas aún no permitieron establecer el

serotipo.

Prueba

Agar hierro de Kligler - / + / + / +

Ureasa -

LIA V / V / +

ONPG -

Resultado Salmonella spp.

Tabla IV.10. Resultados de las pruebas bioquímicas realizadas a partir de colonias

provenientes del cultivo de meconio. La prueba de agar hierro de Kligler evalúa

fermentación de lactosa, fermentación de glucosa, producción de SH2 y utilización

de catalasa, presentándose en dicho orden en la tabla como positivo (+) o

negativo (-). Para el método de LIA, los resultados se expresan según el viraje de

coloración observada, así, V denomina el color violeta observado, siendo positiva

a descarboxilación de lisina, tanto en el pico de flauta como en el fondo; en la

misma prueba se vio producción de SH2, indicada con +.

Las pruebas serológicas de la cepa aislada dieron negativas para los serotipos

patogénicos disponibles en el Laboratorio de Bacteriología —i.e. S. Typhimurium, S.

Enteritidis, S. Gallinarum. Debido a la imposibilidad de determinar el serotipo, se

76

procedió a enviar una copia de la cepa a la Administración Nacional de Laboratorios e

Institutos de Salud (ANLIS) "Dr. Carlos Malbrán", en Buenos Aires, para que se realizara

el serotipificado de la misma. Hasta el momento de defensa de la presente tesina, no

se ha obtenido respuesta.

De los resultados obtenidos de la siembra de los órganos (hígado, bazo, ciego y tonsilas

cecales) presentados en la Tabla IV.11., se observa que la totalidad de los ciegos y

tonsilas cecales dieron positivos a la presencia de Salmonella spp. De los resultados

para hígado, se puede observar que todos los tratamientos presentaron niveles de

entre 30 y 60% de positividad, excepto la réplica 2 del Tratamiento 3, que presentó un

87,5%. Para el caso de las muestras de bazo, se observa que tanto los Tratamientos 1 y

2 y réplica 3 del Tratamiento 3 presentaron positividad de entre 50 y 55%, mientras

que las réplicas 1 y 2 del Tratamiento 3 presentaron 75%. Se destaca la baja

positividad del Grupo Control, con sólo 22% de cultivos positivos a Salmonella spp.

Grupo n Hígado Bazo Ciego Tonsilas cecales

(Cantidad y porcentaje de positivos)

T1 9 4 44,4 % 5 55,6 % 9 100 % 9 100 %

T2 8 3 37,5 % 4 50 % 8 100 % 8 100 %

T3 R1 8 3 37,5 % 6 75 % 8 100 % 8 100 %

T3 R2 8 7 87,5 % 6 75 % 8 100 % 8 100 %

T3 R3 8 5 62,5 % 4 50 % 8 100 % 8 100 %

Control 9 3 33,3 % 2 22,2 % 9 100 % 9 100 %

Tabla IV.11. Resultados del análisis bacteriológico de muestras de órganos. En la

tabla se presentan la cantidad y porcentaje de resultados positivos a Salmonella

spp. obtenidos a partir de cultivos de órganos internos muestreados a la eutanasia

—hígado, bazo, ciego y tonsilas cecales.

77

Gráfico IV.5. Resultados del análisis bacteriológico de muestras de hígado y bazo.

Las barras representan el porcentaje de animales con resultado positivo a

Salmonella spp. en hígado y bazo por cada grupo en estudio.

0

20

40

60

80

100

Hígado Bazo

T1

T2

T3 R1

T3 R2

T3 R3

Control

78

V. DISCUSIÓN

Existen múltiples estudios científicos sobre la utilización de probióticos en producción

avícola, principalmente en pollos parrilleros, donde se analizan las características

productivas y la protección frente a enfermedades infecciosas comunes. Entre las

evaluaciones más representativas de mejoría, se estudia la histomorfometría de

vellosidades y criptas de Lieberkühn en intestino de los animales en estudio.

Como se expresó anteriormente, existe una relación entre las tasas de proliferación y

diferenciación celular, y las tasas de digestión y absorción intestinal (Boleli, Maiorka y

Macari, 2002). Sin embargo, Boleli, Maiorka y Macari (2002) indican que la relación

entre altura de vellosidades y profundidad de criptas es tan sólo un parámetro relativo

desde el punto de vista funcional, ya que la proliferación celular ocurre también a lo

largo de las vellosidades hasta en un 50%.

Desde el punto de vista zootécnico, el desequilibrio del proceso de renovación celular

en intestino a favor de un aumento de la tasa de proliferación tiene un importante

papel, lo cual puede ser manipulado para maximizar la superficie de digestión y

absorción, mejorando los resultados productivos. Es importante preservar la integridad

morfofuncional del sistema digestivo, evitando aquellos agentes que provoquen un

desequilibrio del proceso de turnover a favor de la descamación (Boleli, Maiorka y

Macari, 2002).

Conocer el sistema digestivo de las aves hace a la efectividad y economía de los

programas de alimentación en los sistemas productivos (Jacob, Pescatore y Cantor,

2011) ya que una correcta maduración del intestino es de suma importancia para

lograr una buena performance (Boleli, Maiorka y Macari, 2002). El mantenimiento de

la mucosa intestinal en condiciones fisiológicas normales tiene un costo energético

elevado para el pollo. Cuando ocurren lesiones en la mucosa del tracto

gastrointestinal, hay un costo mayor para la renovación del epitelio, por lo que el

rendimiento económico del lote estará comprometido (Maiorka, Boleli y Macari,

2002).

79

Gran parte de la literatura da cuenta que la utilización de probióticos mejora los

valores de altura de vellosidades, profundidad de criptas y la relación entre estas

medidas en intestino delgado. Sin embargo, existen trabajos que presentan resultados

contrarios, al no observarse diferencias significativas entre los animales sujetos a

administraciones de probióticos y los controles.

Awad et al. (2009) estudiaron los cambios morfológicos ocurridos en intestino de

pollitos bajo administración de simbióticos y probióticos, demostrando su potencial.

Ambos tratamientos resultaron en mayores alturas de vellosidades y su relación con

profundidad de criptas en duodeno e íleon. Los autores sugirieron que la alimentación

adicionada directamente con microbios —simbióticos o probióticos— incrementaría el

turnover epitelial, por lo que las vellosidades se encontrarían funcionalmente activas.

Se ha demostrado que Lactobacillus sp. provoca cambios morfológicos, incluidos el

aumento de altura y perímetro de las vellosidades, el grosor de la muscular del

intestino, y la profundidad de las criptas, los cuales aumentarían la superficie de

absorción de la mucosa intestinal (Marie y Smith, 2014). En un estudio realizado en

gallinas y pavos, Dunham et al. (1993) demostraron un incremento en la altura de las

vellosidades del íleon cuando se sometía a las aves a un tratamiento con Lactobacillus

reuteri como probiótico.

Del mismo modo, en estudios que involucraron un desafío con bacterias patógenas, en

particular del género Salmonella, algunos autores indican una respuesta positiva en

cuanto a protección del probiótico mientras otros no vieron diferencias. En particular,

el género Lactobacillus ha sido muy estudiado en cuanto a exclusión de patógenos

entéricos, obteniéndose diversos resultados de un mismo tipo de Lactobacillus (Juárez

Estrada, Molina Hernández y Soto González, 2010). El tratamiento con productos de

exclusión competitiva mejoraría la eliminación de infecciones con Salmonella

concurrentes o pre-existentes (Corrier et al., 1998; Higgins et al., 2007). Sin embargo,

como estos productos son más eficaces al ser administrados previo a la exposición de

patógenos, las infecciones durante incubación y eclosión comprometerían los

resultados de un tratamiento subsecuente (Bailey, Cason y Cox, 1998; Swayne, 2013).

80

La interacción del intestino con el sistema inmune comienza con el establecimiento de

la microbiota y resulta en la infiltración de células inmunitarias —como heterófilos y

linfocitos— en la lámina propia y/o epitelio, y en la normalización del sistema inmune

en el tracto intestinal (Lowenthal et al., 1994; Van Immerseel et al., 2002; Bar-Shira,

Sklan y Friedman, 2003; Crhanova et al., 2011). La población de células infiltradas se

verá modificada según la microbiota. Un conocimiento profundo de los mecanismos de

respuestas e infiltración permitirían luego una modificación activa de la composición

de la microbiota, particularmente en los primeros días de vida, y la potenciación de la

respuesta inmune contra agentes patógenos particulares (Crhanova et al., 2011).

Como Salmonella puede infectar a los pollitos recién nacidos —por ingestión pre- o

post-eclosión—, al encontrar un ambiente intestinal con escasa y frágil microbiota, su

colonización se vería facilitada (Barrow, 1991; Swayne, 2013). Por esto, como indican

Holt y Porter Jr. (1992), es importante que su intestino cuente con una microbiota

establecida que lo proteja de la colonización de este y otros patógenos.

Attia et al. (2012) observaron una reducción completa de S. Enteritidis aislada de

hígado a los 42 días de tratamiento probiótico, concluyendo que la administración de

probióticos permitiría la reducción de aislamientos del patógeno a partir de órganos

internos. Tellez et al. (2001) evaluaron el efecto protector en pollos parrilleros de un

suplemento probiótico frente a un desafío con Salmonella spp., logrando una

disminución de la colonización de hígado, bazo y ciego en los pollos tratados.

Juárez Estrada, Molina Hernández y Soto González (2010) demostraron que distintos

tipos de probióticos disminuyeron significativamente la infección por Salmonella en

órganos internos o tonsilas cecales de aves de la raza Leghorn. En dicho estudio, un

probiótico no definido mostró la misma tasa de invasión a órganos internos en las

fechas evaluadas, en tanto que el definido presentó un aumento gradual de

protección, posiblemente debido a un progresivo establecimiento de su microbiota.

Nisbet et al. (1998) lograron reducir la mortalidad de pollitos de 10-12 días tratados

con microorganismos de exclusión competitiva, y desafiados con Salmonella

Gallinarum.

81

En el estudio de Leandro et al. (2010), todos los grupos no tratados y desafiados

mostraron presencia de Salmonella Enteritidis en todas las edades estudiadas (7, 14 y

21 días de vida), mientras que aquellos que recibieron probióticos y fueron desafiados

mostraron variaciones, lo que sugiere una reducción discreta de la bacteria desafío en

aquellos animales que recibieron probiótico en su ración. Sin embargo, estos autores

indicaron que el período de estudio podría no haber sido el suficiente para observar

efectivamente si existía una eliminación completa de la bacteria desafío en el tracto

gastrointestinal de los pollos en estudio. Tampoco observaron mejores resultados

productivos o tasas de mortalidad en los pollos desafiados. Por otra parte, los pollitos

tratados con probiótico in ovo mostraron un efecto positivo sobre el desempeño

cuando fueron desafiados, a diferencia de los no desafiados. Así, estos autores

concluyeron que la inoculación in ovo con probióticos evita la colonización del buche y

los ciegos frente a infecciones con Salmonella Enteritidis luego de la eclosión, y mejora

el peso vivo de los mismos. Edens et al. (1997) observaron una exclusión casi completa

de Salmonella Typhimurium y Escherichia coli en pollitos inoculados in ovo con L.

reuteri al momento de la eclosión, con una menor mortalidad en esta etapa.

Sin embargo, los estudios revisados presentan ciertas limitaciones. Se podría señalar,

por ejemplo, los diferentes resultados observados en la literatura, que se podrían

deber a múltiples factores —propios del probiótico, de los individuos en ensayo, de la

bacteria patógena desafiada, hasta del manejo a los que fueron sometidos los

animales. De hecho, existe la posibilidad de una interacción de las diferentes especies

y cepas en los probióticos y las bacterias de la microbiota intestinal, la cual ha sido

escasamente estudiada y tal vez explicaría las diferencias de efectividad en la exclusión

de Salmonella por los probióticos (Juárez Estrada, Molina Hernández y Soto González,

2010).

La gran mayoría de los estudios donde se realiza desafío con patógeno, el mismo se

lleva a cabo en simultáneo o posteriormente a la administración del probiótico (Marie

y Smith, 2014), lo cual no implica protección efectiva frente a infecciones adquiridas

previamente, incluso durante la incubación. Algunos ejemplos que cubrirían esta

limitación son los de Edens et al. (1997) y Leandro et al. (2010) donde parte del trabajo

82

implicó pollitos tratados con probióticos in ovo con un desafío posterior —in ovo o

post-eclosión.

La utilización de diversas líneas genéticas, sumada a la escasez de estudios en ciclos

completos de producción, lleva a la dificultad de interrelacionar resultados en pos de

lograr una interpretación más acabada, ya que las mismas cuentan con diferentes

tiempos de crecimiento y desarrollo. Además, la variabilidad de resultados puede

deberse a diferencias en la procedencia geográfica o animal de los probióticos, cepas,

dosis, composición de la dieta, alimentación y/o interacción con otros aditivos

alimenticios (Chesson, 2005; Kazue Otutumi et al., 2012), como también influyen

factores propios de los individuos y el sistema de producción, como edad, raza, tipo de

explotación, uso de antibióticos, estrés y ambiente de la crianza (Blajman et al., 2015).

En la presente tesina, se estudió la calidad protectora de L. reuteri cepa MCY como

probiótico en pollitos provenientes de una granja con antecedentes de Salmonella spp.

Para ello, se realizaron evaluaciones cuanti y cualitativas en pollitos sometidos a

diferentes programas de administración del probiótico. Las mediciones cuantitativas

incluyeron las mediciones histomorfométricas de vellosidades y criptas de Lieberkühn

de duodeno de pollitos de 12 días de vida. Las características cualitativas evaluadas

fueron integridad de la mucosa y la presencia de infiltrado inflamatorio. También se

analizó mediante bacteriología la capacidad de reducir la infección del intestino y de

órganos internos —hígado y bazo.

Los resultados obtenidos demostrarían que no existió una respuesta favorable frente a

la infección que presentaban los individuos estudiados. No existieron diferencias en

cuanto a histomorfometría, integridad de mucosa e infiltrado linfocitario, lo que

indicaría que la cepa de L. reuteri no tuvo efectos sobre la mucosa intestinal en el

contexto de una infección preexistente. Tampoco se observaron mejorías en lo

referente a colonización de órganos internos.

Sin embargo, estudios en animales sanos, con diferentes dosis y vías de

administración, y desafíos a posteriori deberían ser realizados para corroborar si esta

cepa presenta algún efecto sobre la histomorfometría y la defensa frente a las

83

infecciones, en especial Salmonella, ya que es una bacteria de gran importancia en

sanidad avícola y salud pública.

Es válido aclarar que, durante su realización, el ensayo estuvo sujeto a errores

metodológicos independientes del equipo actuante. Al trabajarse con pollitos

infectados con Salmonella spp. desde la granja, no se pudo contar con controles

negativos de pollitos sanos y un desafío controlado. Sabiendo esta limitante y teniendo

en cuenta el objetivo planteado en la presente tesina, se consideró como "controles" a

aquellos pollitos sin tratamiento probiótico, a fin de comparar los posibles efectos del

probiótico tanto sobre la histomorfología como la infección en sí. A su vez, cabe aclarar

que la utilización de pollitos control provenientes de otra granja, o incluso de otro lote

sano de la misma granja, no aseguraría que estos fuesen similares a los individuos en

estudio y, por ende, comparables en sus evaluaciones histomorfológicas.

En cuanto a los protocolos utilizados para las dosificaciones del probiótico y fecha de

eutanasia-muestreo, es de destacar que fueron programadas a entender del equipo

actuante, ya que la bibliografía existente no brinda una base metodológica

estandarizada para los estudios en pollitos. Así, mientras en este estudio se

muestrearon pollitos a los 12 días de vida, otros autores trabajaron con otras edades

—e.g. 10, 14 o 15 días de vida, o incluso mayores. Dicha falta de estandarización en la

investigación avícola lleva a una dificultad mayor al momento de comparar resultados.

Otro punto que algunos autores realizan es el sometimiento de los animales a un

ayuno de 8-12 horas previo a la eutanasia (e.g. Pelicano et al., 2003; de Verdal et al.,

2010), lo cual no fue realizado en el ensayo que se presenta.

Asimismo, en la literatura consultada existen diferencias metodológicas en cuanto a las

mediciones histomorfométricas de las vellosidades. Algunos autores citan que la

vellosidad a medir deberá presentar un epitelio intacto (e.g. Abdel-Raheem, Abd-Allah

y Hassanein, 2012; Gava et al., 2015), mientras que otros utilizan como referencia la

lámina propia intacta (e.g. Uni, Noy y Sklan, 1995; Samanya y Yamauchi, 2002; Awad

et al., 2009) o directamente no establecen esta preferencia (e.g. Uni, Ganot y Sklan,

1998; Pelicano et al., 2003, 2005; Nicoletti et al., 2010). Incluso, existe variedad entre

el segmento de intestino evaluado, por lo cual Gava et al. (2015) propusieron que el

84

yeyuno sería la mejor porción para evaluaciones de histomorfometría intestinal en

pollo. Estas diferencias metodológicas aumentan aún más la dificultad de comparación

entre los distintos trabajos científicos.

A su vez, para mejorar la calidad de los resultados y lograr un estudio más profundo e

integrado, se podrían aumentar los datos recolectados y analizados. Así, se podría

evaluar recuento de los distintos tipos celulares, medición de las túnicas histológicas,

densidad de vellosidades, pesado y medición del intestino, pesado de los pollitos,

conversión alimenticia, recuentos bacterianos en intestino y hasta mortalidad frente a

desafíos bacterianos.

Como se describe anteriormente, algunos autores realizan la medición del ancho de las

vellosidades, e incluso calculan el perímetro y/o superficie de las mismas. Sin embargo,

en esta tesina se considera que dichas mediciones no serían aplicables a las

vellosidades de las aves, ya que, a diferencia de los mamíferos, estas presentan una

forma de hoja con una disposición en zig-zag. Debido a esta morfología característica,

al corte histológico sería posible seccionar vellosidades en distintos ángulos,

obteniendo, por ende, diversos anchos de las vellosidades.

Por otra parte, es importante evaluar los planes sanitarios aplicados a los pollitos en

ensayo. En nuestro estudio, los pollitos contaron con un plan sanitario básico al día de

vida, brindado por la granja de procedencia, lo cual resulta en otro factor ajeno al

equipo de trabajo que podría influir sobre los resultados.

Los productos probióticos disponibles en el mercado son numerosos y variados, pero

mientras algunos tienen potencial, en otros la eficiencia no es clara. Conocer los

mecanismos de acción y establecer estándares para las alternativas de antibióticos son

una necesidad clave (Huyghebaert, Ducatelle y Van Immerseel, 2011). En la

investigación aplicada a la producción avícola, aún son necesarios estudios que

descifren los mecanismos de la microbiota sobre el desarrollo intestinal, la regulación

de la inflamación, el aprovechamiento de los nutrientes, y los efectos sobre el

metabolismo energético, información de gran utilidad en el desarrollo de productos

con efectos específicos (Pedroso y Lee, 2015).

85

Si los microorganismos probióticos no encuentran un ambiente favorable en el

intestino, no resultará exitosa su utilización. Como solución a esto, Apajalahti et al.

(2004) sugieren a los simbióticos como productos más adecuados, ya que la fórmula

contiene las bacterias probióticas y los componentes prebióticos que favorecen su

crecimiento. Por esto, se considera de sumo interés que, luego del estudio completo

de la cepa probiótica evaluada en la presente tesina, se prosiga con estudios de su

acción junto a elementos con los cuales conforme un producto simbiótico superador.

Al considerar las diferencias obtenidas por los diversos estudios, Juárez Estrada,

Molina Hernández y Soto González (2010) consideran que se debe plantear una

metodología estandarizada que permita la evaluación de los probióticos bajo las

mismas premisas. Así, resultaría conveniente lograr un consenso de la comunidad

científica para el desarrollo de un protocolo estándar, en especial para los estudios

anatómicos e histomorfométricos.

86

VI. CONCLUSIONES

Los resultados obtenidos en el presente trabajo permiten concluir que la utilización de

probiótico en base a Lactobacillus reuteri cepa MCY una vez instalada la infección por

Salmonella spp. no significaría una alternativa efectiva en cuanto a histomorfometría

duodenal, eliminación de la infección y la prevención de la colonización de órganos

internos. Estudios posteriores serán necesarios para evaluar los efectos de la cepa en

animales sanos, con diferentes vías de administración y frente a desafíos bacterianos.

Adicionalmente, se logró una estandarización de la concentración de Lactobacillus

reuteri cepa MCY en inóculos a partir de caldo MRS y 48 horas de crecimiento.

Por otra parte, al no existir protocolos consensuados para estudios similares, se

concluye que sería importante que la comunidad científica desarrollara un protocolo

estándar para la investigación aplicada a la producción avícola.

87

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Then do not stop to think, about the reasons for what you are doing,

about why you are questioning. The important thing is to not stop

questioning. Curiosity has its own reason for existence. One cannot

help but be in awe when he contemplates the mysteries of eternity,

of life, of the marvelous structure of reality. It is enough if one tries

merely to comprehend a little of this mystery each day. Never lose a

holy curiosity. Try not to become a man of success but rather try to

become a man of value. He is considered successful in our day who

gets more out of life than he puts in. But a man of value will give

more than he receives.

—Albert Einstein. Old Man's Advice to Youth: 'Never Lose a Holy

Curiosity.' LIFE Magazine. 2 de Mayo de 1955.