Factores Que Afectan La Estabilidad de Las Proteinas a Corto y Largo Plaz1

8/19/2019 Factores Que Afectan La Estabilidad de Las Proteinas a Corto y Largo Plaz1

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FACTORES QUE AFECTAN LA ESTABILIDAD DE LAS PROTEINAS A CORTO YLARGO PLAZO.

1. INTRODUCCIÓN

El aislamiento y la purificación de una proteína es a menudo perjudicial para suestructura y actividad biológica, en particular en el caso de las proteínas

intracelulares que protegidos por el medio celular. Una serie de factores puedecausar daño a las proteínas aisladas, incluyendo concentraciones demacromoléculas y compuestos de baja masa molecular, pH, fuera iónica,

potencial redo! y la temperatura. "omo consecuencia, las proteínas pueden ser covalente o no covalentemente modificados, dando como resultado cambios y # o

agregación conformacionales. Ha sido $abitual utiliar un denominadoestabiliador de proteínas para mantener la conformación nativa de las proteínasdurante el aislamiento y almacenamiento %&'().*a mayoría de las proteínas son sólo marginalmente estables a pH neutro y la

temperatura ambiente y por lo tanto se desnaturalian f+cilmente por el aumentode de ve en cuando la disminución dela temperatura y la presión, por loscambios de pH, adición de urea, H"l de guanidina y sales caotrópicas, como

congelación'descongelación y liofiliación procedimientos %'&/). 0e $ademostrado que muc$os aditivos, tales como a1cares, ciertos amino+cidos,algunas aminas, y glicerol, estabilian proteínas contra estas tensiones %&&'

23). 0in embargo, en muc$os casos el uso de estos aditivos es insuficiente paraestabiliar proteínas por completo."ongelación'descongelación y la liofiliación son los métodos m+s com1nmenteutiliados para el almacenamiento a largo plao de las proteínas,aunque muc$as proteínas no son estables frente a estas tensiones %4/'

45). 6ecientemente, "arpenter y "ro7e % 4/ ) e!aminaron una serie decompuestos por sus efectos sobre la retención de la actividad de la enima sobrecongelación'descongelación y la liofiliación . 8quellos compuestos que sonconocidos para estabiliar las proteínas en la estabiliación de las proteínasprotegidas solución de daños de congelación'descongelación y aquelloscompuestos que son conocidos para desnaturaliar o desestabiliar las proteínasmejorada daño debido a la congelación'descongelación .9or lo tanto, se propuso que el mecanismo para la estabiliación co'soluto deproteínas durante la congelación'descongelación es el mismo que el descrito para

la estabiliación en el estado de solución %4/). 9or otro lado, los investigadoresencontraron que sólo los sac+ridos protegidos proteínas de daño de liofiliación

%42,44,4:,4(). "ro7e et al. %4) llegó a la conclusión de estos resultados que lastensiones derivadas de la liofiliación son fundamentalmente diferentes de losdebidos a la congelación'descongelación.En la estabiliación in vitro de proteínas por la co'solutos aparece a paralelo de losmedios para la estabiliación de macromoléculas que es utiliada por un n1merode organismos que se adaptan a condiciones e!tremas, tales como alta

osmolalidad, la congelación y la des$idratación. *os organismos que viven en


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condiciones de alta osmolaridad, o que son resistentes a la congelación, seacumulan una gran variedad de compuestos, llamados osmolitos, para elevar lapresión osmótica del citoplasma o servir como crioprotectores, respectivamente.Estos compuestos son aparentemente no perturbadora a las macromoléculas y

son también estabiliadores de proteínas %4;' 55). 9or otra parte, los compuestos

que son utiliados por organismos que pueden sobrevivir en baja actividad deagua se limitan a disac+ridos %5:'5;).


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2. Factores !e a"ecta# $a esta%&$&'a' 'e$ esta'o 'e so$!c&(#.

*a discusión detallada del mecanismo de la estabiliación de la proteína ensolución inducida por co'solutos se presentar+ m+s adelante. En resumen, se $a

observado e!perimentalmente que e!iste una deficiencia en la estabiliación deco'soluto en la región inmediata de la proteína en relación con la solución agranel-, y que la proteína se e!cluye preferentemente de contacto con la superficiede la proteína. 9or lo tanto, como =imas$eff y sus colegas e!plican, la presenciade estos co'solutos en una disolución de proteína crea una situacióntermodin+micamente desfavorable, ya que se aumentan los potenciales químicosde la proteína y el aditivo. En otras palabras, un estado entrópicamentedesfavorable se produce cuando las moléculas de co'soluto se e!cluyenpreferentemente del contacto con la proteína. En consecuencia, la estructuranativa de monómeros y la forma polimeriada de proteínas oligoméricas seestabilian porque la desnaturaliación o disociación daría lugar a una superficiede contacto mayor entre la proteína y el disolvente y, por lo tanto, aumentar esteefecto termodin+micamente desfavorable.*os efectos de los co'solutos se pueden e!aminar de forma m+s cuantitativa. 0e$a observado que la estabiliación de las proteínas por los co'solutos esdependiente de la concentración, y que la estabiliación se $ace evidente sólo aconcentraciones relativamente altas de co'soluto por ejemplo, ./.4 ?-. En talesconcentraciones altas, la interacción no implica la formación de complejosestequiométricos, pero representa las cantidades promediados de loscomponentes presentes en el volumen de disolvente de forma permanente otransitoria perturbado por la proteína, que refleja tanto fuerte y débil, así comointeracciones de atracción y repulsión. 8dem+s, la interacción incluye la cantidadde agua de unión $idratación- a la proteína, ya que, por un sistema de tres

componentes, el par+metro de interacción ξ4- se e!presa a presión constante y latemperatura por la ecuación.&- en la que los componentes de la solución see!presan mediante los subíndices &, 2 y 4 componente &BH2C, componente2Bproteína y componente 4Bco'soluto-, g& es la concentración del componente i engramos por gramo de H2C, y 8i es la cantidad de componente i de unióninteractuar- a la proteína en gramos por gramo. 9or simplicidad, los subíndices

que e!presan temperatura y presión constantes se omiten-.El ξ4 par+metro se puede determinar e!perimentalmente mediante di+lisis deequilibrio. En eq. &-, es evidente que, a alta concentración de co'soluto, la$idratación de proteínas $ace una contribución significativa al valor de interaccióndeterminado e!perimentalmente. ?+s importante a1n, la interacción preferencialno la cantidad de unión real 84- es la interacción que determina el efecto de la co'soluto en la estabilidad de la proteína. 0upongamos la siguiente desnaturaliaciónde equilibrioD

Eq. 1


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8unque este mecanismo se aplica a la desnaturaliación reversible de lasproteínas, los mismos compañeros de solutos pueden estabiliar las proteínasfrente a la desnaturaliación irreversible y desactivación. El proceso irreversiblepuede ser mejor descrito como @< I


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incrementa por la adición de glucosa, ya que una transferencia de energía libremayor del estado desnaturaliado $ace que la energía libre de desnaturaliacióna1n mayor.

Aigura &. 9arcela de el par+metro de interacción preferencial αm2 # αm4- frente ala concentración de glucosa m4-. *os símbolos son ribonucleasa K-, alb1mina desuero bovino a un pH de (,/ L- y a pH 4,/ M-, quimotripsinógeno N-, y lalisoima O-. 6eproducido con permiso de 8ra>a7a y =imas$eff %24).


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nativo, y por lo tanto debe desestabiliar las proteínas. *os ejemplos de lassustancias que pertenecen a esta clase son ?g"l2, clor$idrato de guanidina,0"@, y urea.Este caso también se representa en la Aig. 4. En la presencia dedesestabiliadores, la energía libre de la desnaturaliación se $ace m+s pequeño

y por lo tanto se reduce la estabilidad de la proteína. En desnaturaliaciónsistemas de disolventes, la energía muc$o m+s favorable de transporte gratuitopara el estado desnaturaliado invierte los estados de energía libre de los estadosnativa y desnaturaliada. 9or lo tanto, en este caso el estado desnaturaliado tieneuna energía libre menor que el estado nativo y por lo tanto la proteínadesnaturaliada es m+s estable fig 4-. 'Una fuerte correlación entre la estabiliación de la solución y la interacciónpreferencial se $a observado para muc$os compuestos. 8quellos compuestos queest+n fuertemente e!cluidos de la superficie de la proteína estabilian proteínascontra diversas tensiones impuestas a las proteínas en solución. Hay, sinembargo, algunas e!cepciones a esta regla, por ejemplo, 9EF polietilenglicol- y?9


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$idrofóbicos en las moléculas, mientras que la segunda clase tiene car+cter $idrófobo. Esto implica que los compañeros de solutos tales como 9EF y ?9


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efectos de ?9< y 9EF sobre la estabilidad de proteínas son dependientes de latemperatura. Esto se e!plicar+ adicionalmente en la sección siguiente, cuando sedescribe el mecanismo de la estabiliación de la proteína por los co'solutos contrael estrés de congelación'descongelación.

). Factores !e a"ecta# a $a esta%&$&'a' 'e co#*e$ac&(#+'esco#*e$ac&(#

Hay varios puntos en el procesamiento, el almacenamiento y el montaje de lasproteínas que al congelarse y descongelarse puede alcanar, ya sea por el diseñoo por accidente. 8lgunas proteínas se congelen por un periodo muy largo ydespués se descongelan para su uso. Ccasionalmente, las proteínas liofiliadasson re$idratadas, se dividen en alícuotas y se almacenan congeladas. Elalmacenamiento congelado también puede servir como una medida provisionalpara tener lotes de proteínas, antes de la preparación de un lote grande por liofiliación. 0in embargo, incluso en formulaciones líquidas, e!iste una necesidadde estabiliar proteínas contra la congelación y descongelación, debido a los

riesgos de congelación accidental, durante el transporte y la manipulación. 9or 1ltimo, la tensión de congelamiento que se alcana durante la liofiliación, debeser tomada en consideración cuando se diseñan estrategias de formulación parala liofiliación.*as tensiones m+s críticas a la que una proteína se e!pone durante la congelaciónson una baja temperatura y la formación de $ielo. *a desnaturaliación fría $a sidoclaramente documentada para muc$as proteínas y, por sí misma es suficientepara e!plicar la inactivación de muc$as proteínas durante la congelación'descongelación. =ambién, ya que la proteína es e!cluida de los cristales de $ielodurante el congelamiento, las moléculas de proteínas se someten a cambiosquímicos y físicos que ocurren en la fase no congelada. "omo se forma $ielo, la

concentración de todos los solutos incremente dram+ticamente. 0i los solutospresentes en la fracción sin $ielo est+n desestabiliados, entonces, este efectopuede llevar a la desnaturaliación de la proteína. 9ara la mayor parte, lainfluencia cualitativa de solutos en la estabilidad de proteínas durante lacongelación'descongelación imita aquel que se nota en una solución acuosa nocongelada. 9or 1ltimo, cabe mencionar que una solución que contienecomponentes buffer tales como el fosfato de sodio puede someterse a unadram+tica disminución en el pH en el punto eutéctico. Gncluso cuando talestensiones individuales no dañan la proteína, una combinación de factores quesurgen durante la congelación'descongelación, incluyendo bajas temperaturas yuna alta concentración de sal desestabiliadora, puede ser muy destructiva.

8dem+s, la duración de la e!posición de una proteína a condiciones deperturbación puede influir en cuanto daño puede ocurrir.

Esto se refleja en el $allago de que la pérdida de la actividad enim+tica durantela congelación y descongelación a menudo se correlaciona inversamente con lastasas de enfriamiento y calentamiento. *a estabilidad de una proteína en contra deestas perturbaciones se puede aumentar de un modo específico de la proteína por varios medios. En general, cualquier factor que altere la estabilidad de la proteína


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en solución acuosa no congelada tienden a tener el mismo efecto cualitativodurante el congelamiento'descongelamiento. Es decir, si las condiciones desolución tales como el pH y la concentración de proteínas son elegidos que dan lam+!ima estabilidad en solución, a continuación, la proteína tiene la m+!imaestabilidad in$erente definida como la capacidad de una proteína para soportar

una tensión dada independiente de cualquier soluto o cofactor- durante lacongelación'descongelación. 9or ejemplo, con muc$as proteínas, se $aencontrado que incrementando la concentración de proteínas incrementar+ laestabilidad de la proteína en solución y también durante la congelación'descongelación.


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9or el contrario, los compuestos que se sabe que se unen preferentemente aproteínas, tales como urea y guanidina'H"l, fomenta daño adicional durante lacongelación'descongelación. 8sí, el mecanismo demostrado por =imas$eff y suscolegas para la estabiliación de proteínas en un sistema acuoso no congeladoaparentemente aplica igualdad en la criopreservación de proteínas. Es decir, a

temperaturas bajo cero, concentración de solutos inducida por congelación,alteraciones en la solución de pH, y otras condiciones de inestabilidad que puedensurgir durante la congelación'descongelación pueden verse simplemente comootros tipos de perturbaciones inducidas en la solución. 9referentemente los solutose!cluidos sirven para evitar estas tensiones de la desnaturaliación de la proteínadurante la congelación y descongelación.

Esta conclusión es sencilla si se tiene en cuenta que las interacciones tanto de ladesestabiliación y la estabiliación de solutos con las proteínas durante lacongelación y descongelación actualmente ocurren en la fase acuosa sin $ielo.

8dem+s, los principios termodin+micos b+sicos que rigen la estabilidad de laproteína en estado de congelación no deben ser diferentes de los operativos ensistemas acuosos no congelados. 0in embargo, como se señaló anteriormente,$ay un grupo de compuestos para los que su influencia en la estabilidad de laproteína en solución acuosa no se correlaciona con su efecto durante lacongelación'descongelación. 0e $a demostrado que los compuestos tales como9EF y ?9< son e!cluidos de la superficie de proteínas a 2/S" y son e!celentescrioprotectores.


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El secado por congelación o mejor conocido como liofiliación se utilia en la

preparación de productos de proteínas que no son suficientemente estables para

su almacenamiento a largo plao en forma de soluciones acuosas. El proceso de

liofiliación consiste en la congelación de la solución de la proteína y

posteriormente es secado por medio de vacío. El proceso de secado se lleva a

cabo en dos fasesD secado primario, elimina el agua congelada por sublimación, y

el secado secundario que elimina el agua no congelada unida. *a liofiliación a

menudo presenta problemas de estabilidad debido a la inestabilidad

conformacional de muc$as proteínas cuando son sometidas al proceso de la

congelación y a las tensiones de des$idratación posteriores. *a proteína debe ser

estabiliada contra estas dos tensiones fundamentales. 9ara ma!imiar la

estabilidad del proceso de liofiliaciónción se deben optimiar par+metro comoD las

temperaturas, tiempo y la $umedad residual. 0in embargo, en muc$os casos, la

optimiación de estos par+metros es insuficiente. 9ara mejorar a1n m+s la

estabilidad de las proteínas liofiliadas, a menudo se añaden diferentes tipos dee!cipientes a la solución que contiene la proteína.

@umerosos informes $an dado resultados empíricos de la liofiliación, usando

diversas proteínas y utiliando diferentes aditivos para mejorar la estabilidad

durante la liofiliación para su posterior almacenamiento. El mecanismo de

estabiliación de co'soluto durante la liofiliación también $a sido el tema de

muc$os informes. 9or ejemplo, la fosfofructoquinasa 9A- es una enima

tetramérica que se disocia en componentes monoméricos por la congelación y # o

secado, un proceso que desnaturalia irreversiblemente a dic$a molécula. *a

protección puede conferirse contra cualquiera de estas dos tensiones con la

adición de estabiliadores llamadosD co'solutos. 0in embargo, los requisitos para

la protección contra la des$idratación son muc$o m+s específicos. ?uc$os

crioprotectores efectivos no tienen efecto estabiliador durante la des$idratación.

*os 1nicos solutos que $acen proporcionar la estabiliación son los disac+ridos.

Este mecanismo todavía no se entiende completamente, por lo que se prefieren

los co'solutos. El fracaso de muc$os crioprotectores para proteger

adecuadamente en secó, indica que el mecanismo de estabiliación del soluto'

inducido durante la des$idratación es fundamentalmente diferente al de las

proteínas en sistemas acuosos o congelados. 8dem+s, los argumentos

termodin+micos necesarios para e!plicar la estabiliación de las proteínas por lapreferencia de co'solutos no son aplicables cuando el disolvente se elimina del

sistema.En informes anteriores sobre la estabiliación de las proteínas secas,

"arpenter y "ro7e sugieren que ciertos carbo$idratos podrían proteger a las

proteínas ya que estos co'solutos tienen puentes de $idrógeno unidos a la

proteína seca, por lo que sirve como sustituto del agua, cuando se retira la capa

de $idratación de la proteína. 9ara probar dic$a $ipótesis, "arpenter y "ro7e


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utiliaron Aourier transformado con espectroscopia infrarroja A=G6- para

observar las interacciones entre las proteínas y los carbo$idratos secos. 0e

encontró que el $idrógeno no sólo produce la unión entre las proteínas y los

carbo$idratos estabiliadores, sino también que dic$a unión es un requisito para

las proteínas l+biles que se conserva durante el secado. *os resultados que

describen a la tre$alosa y las interacciones de las proteínas en estado seco se

pueden ver en la figura : con diferentes puntos se compara la región de $uella

dactilar del espectro de infrarrojo para la tre$alosa sola contra el de la tre$alosa

seca, ya sea con lisoima o con alb1mina de suero bovino. *a presencia de la

proteína conduce a una disminución en la absorbancia en toda la región, cambios

en la posición de la banda, y una pérdida de la división de la banda. Estos

cambios espectrales de proteína inducida pueden ser tratados liofiliando el

a1car incrementando la cantidad de la proteína. *os espectros típicos para la

tre$alosa en secó en presencia de lisoima o alb1mina de suero bovino son

notablemente similares a las de tre$alosa $idratada, pero muy diferente alespectro de tre$alosa cristalina. 9or lo que las proteínas aparentemente juegan el

mismo papel, para la tre$alosa en secó al igual que el agua para el a1car

$idratado, forman puentes de $idrógeno con los grupos polares del a1car. Vueda

implicito en la conclusión de que las proteínas sirven como sustitutos de agua para

los carbo$idratos en polvo, para cumplir con las necesidades de puentes de

$idrógeno de los grupos polares, así que lo contrario también debe ser verdad.

9ara probar esta $ipótesis, se investigó la influencia de la tre$alosa en el espectro

infrarrojo de la lisoima. "uando se seca la lisoima sin el a1car, la frecuencia de

la banda amida G da un n1mero de onda de &(:2, mientras que para la proteína

completamente $idratada da un n1mero de onda de &(:3. En el caso de la amida

GG la banda se amplía dando un n1mero de onda de &:54 a casi &:4/ con la

proteína seca. En contraste, cuando la lisoima se seca por congelación en

presencia de tre$alosa : g de proteína de a1car # g-, la banda de amida G de la

proteína seca es desplaada $acia atr+s dando un n1mero de onda de &(:;. El

efecto m+s dram+tico del a1car es cambiar la banda de la amida GG de nuevo a

&:52 cm,que dic$a posición es casi idéntica también para la proteína $idratada.

0e observa adem+s en este estudio que cuando se usan altas concentraciones

iniciales de tre$alosa, el espectro de la proteína se desplaa de nuevo a la formaconocida de la proteína seca y sin el a1car. *a cristaliación de la tre$alosa

durante la sublimación disminuye la disponibilidad del a1car para formar puentes

de $idrógeno con la proteína. 8 altas concentraciones de manera similar, la

capacidad de la tre$alosa para proteger la actividad de la fosfofructoquinasa es

suprimida. 9or lo tanto, "arpenter y "ro7e concluyeron que cuando la tre$alosa

est+ en una concentración que no influye en la frecuencia de la banda de la amida


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GG para la lisoima en seco, esta concentración de a1car también es inefica para

preservar el secado y proteínas labiales. Es decir, los puentes de $idrógeno del

a1car en la proteína son obligatorios para preservar proteínas secas.

En un informe de =ana>a emplearon un enfoque diferente para e!aminar el

mecanismo de protección de liofiliación por sac+ridos. Estos investigadores

e!aminaron la protección de la actividad de la catalasa durante la liofiliación por

valoración de diversas concentraciones de la enima con diferentes sac+ridos. *os

resultados indicaron que el par+metro correlacionado con la protección de la

actividad de la enima fue la relación del peso del e!cipiente a la proteína y no una

concentración mayor de e!cipiente. Este resultado sostiene que una interacción

directa entre las moléculas del e!cipiente y la proteína es la base para

lioproteccion. "laramente, si la interacción directa no fuera un factor necesario y el

mecanismo implicado para la formación de cristales o de pedida de agua, una

concentración mayor del aditivo se correlaciona con la protección. 9ero esto no seobservó. Estos resultados apoyan adem+s la afirmación de que la interacción

directa de los estabiliadores con la proteína es necesaria para la estabiliación.

En otro estudio, *ippert y Falins>i encontraron que la estabiliación de 9A y

lactato des$idrogenasa liofiliado *al observó que las formulaciones que contienen de!trano, que sigue siendo

completamente amorfo y forma un cristal, desestabilian a la estructura de laproteína y da como resultado un alto grado de formación de agregados después

de la reconstitución. En segundo lugar, en el estudio que se señaló anteriormente

por =ana>a, los autores e!aminaron la capacidad de diversos monómeros y

oligómeros de sac+rido para proteger a la catalasa durante la liofiliación. 0e

observó que la capacidad de protección disminuyó a medida que la longitud de la

cadena aumentaba. 9or el contrario, como la longitud de las cadenas de los


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sac+ridos aumentaron, se convirtieron en mejores formadores de cristales es

decir, que se sometieron a temperaturas m+s altas para el cambio a cristales-. 0i

la formación de cristales es el mecanismo de protección, se esperaría una mayor

estabilidad con las cadenas m+s largo de sac+rido. 0in embargo, se observa lo

contrario. 8dem+s, estos autores también e!aminaron la capacidad del de!trano,

con un nuevo un e!cipiente que forma cristales amorfos, para preservar la

actividad de la catalasa después de la liofiliación. 0e observó que el de!trano no

fue tan efica en la estabiliación de la catalasa como los sac+ridos de menor

masa molecular y, adem+s, que la eficacia del de!trano disminuyó a medida que

aumentó la masa molecular. Esto se atribuyó a la incapacidad del polímero grande

para interactuar eficamente con los grupos polares de la superficie de la enima.

9or lo tanto, mientras que la formación de un estado crsitalino amorfo es

claramente una condición necesaria para la estabiliación de proteínas durante la

des$idratación, estos dos estudios independientes indican claramente que la

formación de cristales no es una condición suficiente. "laramente, otrasinteracciones, tales como las descritas anteriormente, son necesarias.

i et al., e!aminó la

conformación de las proteínas liofiliadas utiliando espectroscopia de resolución

mejorada A=G6. Estos estudios proporcionan información adicional sobre el

mecanismo de la desestabiliación de proteína durante la des$idratación y la

estabiliación soluto'inducida. *a comparación de los espectros de infrarrojo de las

proteínas en el estado seco y las proteínas $idratadas en estado natural indica

que durante la des$idratación se inducen de moderados a grandes cambios

conformacionales dependiendo de las proteínas estudiadas- Aigura -.


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Aig. . 0econd derivative infrared spectra of 8- basic fibroblast gro7t$ factor, X- g'interferon and "- a'lactalbumin in t$eaqueous state upper curves- and de$ydrated state lo7er curves-. 6eproduced from 9restrels>i et al.

En varios casos, se observaron desnaturaliación y agregación durante la

re$idratación, lo que indica que los cambios observados en las proteínas secas

son a veces irreversibles. En contraste, cuando estas mismas proteínas se

liofiliaron bajo las mismas condiciones, pero en presencia co'solutosestabiliantes es decir, los que son eficaces en la conservación de la actividad de

enimas l+biles durante la liofiliación y la re$idratación-, la estructura natural o

acuosa se conserva en el estado seco, como se muestra en la Aig. ;.


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Aig. ;. 0econd derivative infrared spectra in t$e amide G region for 8- basic fibroblast gro7t$ factor, X- g'interferon and "-

a'lactalbumin. *yop$ilied in t$e presence of 2// mg#ml sucrose. 6eproduced from 9restrels>i et al.

*a comparación de estos espectros con los espectros acuosos en la Aig.

muestra que, en presencia de aditivos estabiliantes, las estructuras de las

proteínas des$idratadas son esencialmente idénticas a las del estado acuoso.

8dem+s, después de la re$idratación, el estado natural también se conservó

cuando las proteínas se liofiliaron en presencia de estabiliantes. Xas+ndose en

estos resultados, se plantea la $ipótesis de que la preservación de la estructura

natural es necesaria para preservar la actividad biológica tras la reconstitución, y

que el efecto de los co'solutos estabiliantes es a través del mantenimiento de la

estructura natural en el estado des$idratado.


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9restrels>i et al., e!aminó también la conformación de un modelo de polipéptido,

poli'*'lisina, tras la liofiliación. Encontraron que, al igual que con las proteínas, la

liofiliación indujo una transición conformacional. *a poli'*'lisina se transforma de

una conformación aleatoria en solución a una Y'$oja plegada en el estado seco.

*a transición fue atribuida a la pérdida de enlaces $idrógeno unidos al agua,

debido a que una espiral al aar en solución tiene sus enlaces de $idrógeno

satisfec$os por las moléculas de agua. =ras la des$idratación, estas moléculas de

agua se eliminan y los $idrógenos del péptido se unen entre sí. 0e observó que

los sac+ridos in$iben la transición conformacional observada, presumiblemente

por servir como un sustituto del agua. Estos estudios de apoyan el argumento de

que los cambios conformacionales como el desplegamiento- son responsables de

la pérdida de actividad biológica durante la liofiliación y que los sac+ridos

protegen a las proteínas mediante la preservación de su estructura natural,

presumiblemente por enlaces de $idrógeno.

Un dilema aparente surge del argumento de que ciertos aditivos estabilianproteínas secas a través de los enlaces de $idrógeno a las proteínas en lugar deagua. 0i fuera necesaria sólo esta interacción para que la conservación de laproteína durante todo el proceso de liofiliación, entonces los mono' y disac+ridosdeben proporcionar una protección similar. Este no es el caso. "uando 9Afosfofructoquinasa- se seca por congelación en presencia de tre$alosa /,2'/,5 ?,m+s del (/T de la actividad inicial se recupera después de la re$idratación. Encontraste, cuando se utilian cantidades similares de glucosa, la recuperación esinferior a :T. 9A y otras proteínas l+biles son sensibles tanto a la congelación yel estrés de la des$idratación subsecuente encontradas durante la liofiliación. *aglucosa no protege la 9A liofiliada porque proporciona una estabiliación

mínima durante la congelación, mientras que la tre$alosa es efica en laestabiliación de la enima durante tanto la congelación como en lades$idratación. 9or lo tanto, un aditivo dado podría ser muy efectivo en laestabiliación de una proteína contra el estrés de la des$idratación. 0in embargo,si este mismo compuesto no proporciona crioprotección a la proteína, no serealiar+ la preservación durante la liofiliación.


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protección durante la des$idratación. En este esquema de estabiliación, se utilió

9EF polietilenglicol- como un crio'protector y diversos carbo$idratos se utiliaron

como lioprotectores. "omo se muestra en la Aig. 3, el 9EF es un crio'protector

muy efica pero proporciona estabiliación muy baja o nula durante la

des$idratación. 0in embargo, cuando pequeñas cantidades de tre$alosa, así como

otros sac+ridos y alco$oles poli$idro!ilados se titulan, los dos componentes

proporcionan una e!celente estabiliación de las proteínas. En contraste, la

tre$alosa u otros sac+ridos y alco$oles poli$idro!ilados- por sí sola no

proporcionar estabiliación a estas concentraciones Aig. 3X-. 9or lo tanto, en las

condiciones en que la crio'protección es provista por otro co'soluto, la glucosa y la

tre$alosa son igualmente eficaces en la estabiliación de las enimas secas.

Aig. 3. 8- Effect of polyet$ylene glycol on p$osp$ofructo>inase stability during freeeZt$a7ing o- and freee'drying [-. X-"omparison of t$e influence of tre$alose alone o- and tre$alose 7it$ &T 7#v- polyet$ylene glycol N- on t$e stability of freee dried p$osp$ofructo>inase.

En un estudio estructural complementario de estabiliación de un estrés concreto

utiliando espectroscopia infrarroja, 9restrels>i, et al., encontraron que la

recuperación de la actividad después de la re$idratación se correlaciona

directamente con la capacidad de los sistemas de e!cipientes para conservar la

estructura natural de las enimas l+biles en estado seco. "uando la combinación

de 9EF y los carbo$idratos se liofilia con las proteínas, la estructura natural se

observa en el estado seco. 0in embargo, cuando se usan estos e!cipientes solos,

o no se utilian e!cipientes, se observa una estructura desplegada en estado


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seco, esto es, que se requiere la preservación de la estructura natural durante la

des$idratación para la recuperación de la actividad después de la re$idratación.

En resumen, el mecanismo de estabiliación de las proteínas inducida por solutos

durante la liofiliación involucra la interacción directa de moléculas de soluto con la

proteína a través de enlaces de $idrógeno. *as moléculas de soluto sirven como

sustituto del agua. El efecto de la sustitución de agua es el de preservar la

estructura natural de la proteína durante la des$idratación. 9arece importante el

estado amorfo de las moléculas de soluto para permitir el m+!imo de enlaces de

$idrógeno entre moléculas del soluto y proteínas. Ainalmente, para ciertas

proteínas l+biles, un crioprotector también debe ser utiliado durante la etapa de

congelación para proteger a la proteína.

*os estudios de estabiliación de proteínas durante la liofiliación antes descritos,$acen un énfasis durante el proceso de liofiliación en sí. @o obstante, se $a

$ec$o evidente que la estabilidad a largo plao de las preparaciones de proteínasecas es también un factor importante. Una ve m+s, la mayor parte de losinformes de la literatura $asta la fec$a, proporcionan resultados empíricos conpocos datos sobre el mecanismo. Gutsu, et al., $an e!aminado los efectos de losaditivos en la estabilidad a largo plao de la Y'galactosidasa a temperaturaselevadas. ?uc$os aditivos, incluyendo sac+ridos, amino+cidos y alco$oles dea1car, fueron capaces de estabiliar la proteína durante el proceso deliofiliación, pero sólo disac+ridos fueron capaces de conferir estabilidad a largoplao a /\". *os resultados de e!ploración calorimétrica diferencial de lare$idratación de enimas indican que, en ausencia de disac+ridos, las enimas sedespliegan durante el almacenamiento. 9or el contrario, los disac+ridos fueron

capaces de preservar la estructura plegada de la enima. 8sí pues, parece que elmantenimiento de la estructura plegada adecuada durante el almacenamiento alargo plao es necesario para la estabiliación. 0on necesarios m+s estudios, yaque sólo el informe de Gutu, et al., $a abordado esta cuestión a alg1n grado. *osrecientes avances en el e!amen espectroscópico de G6 de conformación de laproteína seca deben proporcionar información valiosa sobre el estadoconformacional a temperaturas elevadas.

. Factores !e a"ecta# a $a esta%&$&'a' 'e a$/ace#a/&e#to a $ar*o -$a0o

*os procedimientos del almacenamiento a largo plao en un estado congelado o

liofiliado son a menudo posibles aunque no son recomendables ya que puedenser m+s perjudiciales para la proteína ya que afectan la estabilidad de la misma.9or otro lado, el almacenamiento de proteínas en estado líquido puede tener muc$as ventajas y por ende es m+s utiliado.

"on la aparición de las proteínas recombinantes de importancia terapéutica, lanecesidad de establecer condiciones para el almacenamiento a largo plao esparticularmente importante. 9or ello, se deben de comprender ciertos eventos que


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pueden comprometer la estabilidad de almacenamiento, por ejemplo, durante elalmacenamiento a largo plao, los grupos sulf$idrilo libres pueden o!idarse a laforma disulfuro. Ctro caso en las proteínas que contienen un par de residuos de"ys, todos los grupos tiol a menudo se pueden o!idar de manera que nopermaneca el grupo tiol libre.

*a gran lista de reacciones que pueden comprometer la estabilidad a largo plaode las proteínas son los del enlace peptídico en sí. =res reacciones sonimportantes en este sentido. En primer lugar es la $idrólisis del enlace peptídico,para formar dos cadenas de polipéptidos m+s pequeñas. En segundo lugar, lamigración de @ nitrógeno- y / o!ígeno- puede conducir a una estructura diferenteen la posición afectada. El tercero implica una migración ]'carbo!i a Y'carbo!i delenlace peptídico.

Ctras cadenas laterales amino'acilo que pueden someterse a modificación duranteun período de tiempo incluyen amida desamidación de 8sn y Fln-, restosarom+ticos o!idación de =rp y =yr- grupos amino acilación del grupo ]'amino dela proteína- y carbo!ilo esterificación de Flu, 8sp, o un residuo "' terminal-.

*a inestabilidad con el tiempo puede surgir una la alteración de la estructurasecundaria, terciaria y cuaternaria de la proteína. ?uc$as fueras, incluyendofueras electrost+ticas, $idrófobas y asociadas a solventes, est+n involucradas enel mantenimiento de la estructura de la proteína. 9or otro lado, algunas regionesde la proteína e!ponen ciertas superficies en el medio ambiente y, con el tiempo,la proteína puede adquirir una estructura diferente. 9or otra parte, las superficies$idrófobas de dos proteínas pueden formar dímeros, que debilitan la estructuraglobal de la proteína. Es por ello que las condiciones de almacenamiento a largoplao deben favorecer a la estructura deseada y disminuir la posibilidad de que seproducan las interacciones proteína'proteína.

:.&. 3ropiedades de los e8cipientes"uando las proteínas se utilian en un entorno clínico como agente terapéutico$umano, ciertos criterios restringen el tipo de e!cipientes que pueden ser utiliados y las condiciones en las que la proteína se somete a almacenamiento alargo plao. *os componentes del e!cipiente deben ser seguros no ser tó!icos niinfecciosos-, la solución empleada debe ser isotónica con respecto a la ruta y elmodo de administración^ por 1ltimo, la elección y la cantidad del buffer utiliado setiene que tomar en cuenta el pH deseado.

:.2. T9cnicas de monitoreo de la estabilidad

9ara evaluar los factores que influyen en el almacenamiento a largo plao de lasproteínas e!isten técnicas indicadoras de la estabilidad las cuales son capaces demedir los cambios de sólo un pequeño porcentaje, los ensayos deben ser f+cilesde realiar y permitir la detección de un gran n1mero de muestras. ?uc$as de lastécnicas que se usan actualmente caracterian las propiedades electroforéticas ycromatogr+ficas de la proteína, estas a menudo detectan la presencia de nuevas


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especies en una región de la electroforetograma o cromatograma que no mostrónada cuando la proteína matri fue sometida a un procedimiento de este tipo. 9or ejemplo, electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio'poliacrilamida detecta laaparición de polipéptidos derivados de la $idrólisis de enlaces peptídicos, elGsoelectroenfoque puede detectar la aparición de formas alternativas, basados en

cambios en la carga, por ejemplo la desamidación, la cromatografía de e!clusiónpor tamaño puede detectar la aparición de agregados. *os cambios en la$idrofobicidad de la proteína se pueden medir por cromatografía líquida de faseinvertida.

:.4. :stabilidad de la proteína

*a identificación de las condiciones adecuadas para la estabilidad a largo plaodeben llevarse a cabo sobre una base de proteínas de tipo estabiliadoras, a partir de estas las patentes y los estudios clínicos publicados suelen dar una descripciónde las condiciones de almacenamiento de la proteína. 9or otro lado, se puedesuponer que las condiciones de e!cipientes enumerados en estos materiales sonadecuados para el almacenamiento a largo plao de la proteína.

*os protocolos de estabilidad deben desarrollarse de forma concomitante con eldesarrollo de proteínas con los f+rmacos.

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Factores Que Afectan La Estabilidad de Las Proteinas a Corto y Largo Plaz1