ברקמות סרטן miRNAsחיזוי השד

small RNA באמצעות sequencing

שם: מירי לוימנחה: ד"ר סול עפרוני

MicroRNAs(miRNAs)

קבוצה של small RNA משמשות תפקיד חשוב במגוון של תהליכים תאיים מולקולות המבצעות רגולציה על הmRNAmiRNA יכול למנוע את תרגום ה mRNA לחלבון או לגרום

.UTR' 3לפירוקו ע"י היברידיזציה עם קצה ה כתוצאה מכך, בקרת הmiRNA משפיעה על ביטוי גנים

לאחר שיעתוק

Small RNA

Non-coding RNA

microRNAs

small RNA sequencing ברקמות סרטן השד באמצעות miRNAsחיזוי

miRNAשלבי התפתחות

miRNA משועתק ע"י RNA polymerase IIכ pri-miRNA -

-60באורך של stem loop למבנה pri-miRNAפירוק ה נוקלאוטידים, 70

, תהליך זה מתבצע ע"י אנדונוקלאז pre-miRNAשנקרא Drosha RNase III

pre-miRNA מועבר מהגרעין לציטופלסמה

דו גדילי באורך miRNA duplex RNA,מתקבל ~ נוקליאוטידים22

,באמצעות miRNAאחד הגדילים מהדופלקס, ה יעכב את הביטוי של גן המטרה. RISCקומפלקס

, יובל לדגרדציה.*, miRNAוהגדיל השני

small RNA ברקמות סרטן השד באמצעות miRNAsחיזוי sequencing

סרטן וסרטן השד המחלה מתאפיינת בצמיחה בלתי מבוקרת של תאים

בגוף.:נובעת מגורמים

גנטייםסביבתייםגנטיים וסביבתיים

סרטן השד המחלה הממארת השכיחה ביותר בקרבנשים בעולם המערבי.

small RNA sequencing ברקמות סרטן השד באמצעות miRNAsחיזוי

סרטן השד – גורמים גנטייםשני גנים שמהווים הגורם השכיח ביותר לסרטן שד תורשתי

BRCA1BRCA2

גנים אלו ממלאים תפקידים חשובים ושונים בתא בתיקון.DNAנזקים ל

ההנחה היא שיש גנים נוספים שעדיין לא זוהו, המעלים אתהסיכוי לחלות בסרטן השד.

נשים נשאיות של מוטציות בBRCA1-ו BRCA2 מצויות בסיכון גבוה לחלות בסרטן שד ובסרטן שחלה.

-להתפתחות 80%-50%הסיכון בקרב נשאיות מוערך בכ -סיכון להתפתחות המחלה 12%סרטן השד , לעומת כ-

באוכלוסייה הכללית.

small RNA ברקמות סרטן השד באמצעות miRNAsחיזוי sequencing

miRNAsוסרטן השד בעשורים האחרונים, מחקרים רבים מראים שביטוי פרופיל

גנטי יכול להוות כלי שימושי לאבחון סוג הסרטן או לבחירת יכול להגדיר סוגי miRNAsסוג הטיפול. פרופיל הביטוי של

משחקים תפקיד מרכזי במגוון miRNAsסרטן. היות ו תהליכים תאיים כמו מטבוליזם, אפופטוזיס, התמיינות

והתפתחות הם גם קשורים למחלות כמו סרטן. הקשר בין miRNAs וסרטן השד נתמך ע"י מחקרים הבוחנים ביטוי miRNAs בסרטן השד בשורה של דגימות קליניות. מחקרים

השונה ברקמות miRNAsאלו מצאו כי ישנו פרופיל ביטוי המתבטאים miRNAsסרטניות מרקמות נורמליות. ישנם

בעודף וישנם כאלה בעלי ביטוי נמוך.

small RNA sequencing ברקמות סרטן השד באמצעות miRNAsחיזוי

Next-generation sequencing מאז פרסום רצף הגנום האנושי, תחום הגנומיקה השתנה באופן

משמעותי וזמינותו של מידע זה הוביל לשגשוג טכנולוגי. פיענוח רצפיDNA וRNA ,הכרחי כמעט בכל ענפי הביולוגיה

מדענים יכלו להשתמש Sanger sequencingעם הופעתו של במידע גנטי של כל מערכת ביולוגית נתונה, טכנולוגיה זו הפכה

נפוצה אך היתה בעלת מגבלות רבות ביכולת התפוקה, מהירות, רזולוציה. לעיתים נמנע מידע הכרחי בשל מגבלות אלה. לשם

השלמת הריצוף היתה אורכת ימים או Sangerהשוואה, בריצוף nextשבועות כתלות באורך הגנום, לעומת זאת בטכניקת

generation sequencing השלמת הריצוף אורכת מספר מרחיב את תהליך הריצוף NGSשעות ללא תלות באורך הגנום.

למיליוני ריאקציות באופן מקבילי, ומאפשר לחוקרים לשאול כמעט כל שאלה גנומית.

האתגרים שמגיעים עם פריצת דרך זו הם רבים, ניתן להשתמשבשיטה כדי לנבות ולאפיין מחלות שמקורן בשינויים גנטיים.

small RNA sequencing ברקמות סרטן השד באמצעות miRNAsחיזוי

תוכנות ביואינפורמטיות המשמשות לחיזוי miRNAsחדשים

כיום יש מספר רב של תוכנות ביואינפורמטיות שפותחו , miRDeep חדשים לדוג'miRNAsע"מ לחזות

miRanalyzer, miRExpress, miRTAP,mirTools .

miRanalyzerבפרוייקט זה השתמשתי בשתי תוכנות: . לשתי תוכנות אלו יש שתי miRDeep2ו

. בפרוייקט זה stand alone ו web serverגרסאות:השתמשתי בגרסה השנייה כיוון שיש לה מספר יתרונות

לדוג' ניתן לשנות ערכי פרמטרים ולהוסיף ספריות באופן עצמאי.

small RNA sequencing ברקמות סרטן השד באמצעות miRNAsחיזוי

מהלך העבודה:

איסוף המידעהתקנת התוכנות לימוד מבנה הקבצים וקריאת מאמרים על הרקע

.הביולוגי והחישובי של התוכנותהרצת כמות גדולה של דגימות וניתוח הפלטים-תוצאות.הסקת מסקנות ועיבוד חישובי

small RNA ברקמות סרטן השד באמצעות miRNAsחיזוי sequencing

איסוף המידע :. הפרויקט אישר כי 2006 החל כתכנית פיילוט בשנת TCGAה

מיפוי של שינויים גנומיים מאפיין סוגי סרטן ספציפיים. בפרוייקט ה TCGA – דגימות 500 נבחנות מספר גדול מאוד של דוגמאות

עבור כל סוג גידול. זאת בכדי לייצר פרופיל גנטי מקיף של כל סוג סרטן .

עובדים על אותן הדגימות. התוצאה היא TCGAכל צוותי מחקר מבט כולל של חקר סרטן ברמה הגנומית.

small RNA ברקמות סרטן השד באמצעות miRNAsחיזוי sequencing

next generationכתוצאה מפיתוח שיטת הריצוף sequencing נוצר הצורך להתמודד עם כמות גדולה של

data ולפתח כלים ביואינפורמטיים שמנתחים את הפלט של miranalyzerסוג ריצוף זה. לאור זאת פיתחו את תוכנת ה small RNAתוכנה שמאפשרת כלי לניתוח הנתונים עבור

deep sequencing experimentsשמתקבלים מ פשוט של שמכיל רשימה של ה- inputכלי זה דורש קובץ

reads הפלטים של מכונת ה(NGS הייחודיים ומספר )העותקים שלהם.

Miranalyzer:מספק את המידע הבא הידועים שמופיעים במאגר miRNAמזהה את כל ה

miRBase. חדשים.miRNAsחוזה

small RNA sequencing ברקמות סרטן השד באמצעות miRNAsחיזוי

Miranalyzer :משתמש ב Weka: אוסף של אלגוריתמים לניתוח נתונים

ומודלים חיזויים. Vienna RNA package: משמשת לחיזוי

.RNAהמבנה השניוני של ה Bowtie: כלי יעיל לביצוע alignment ל short

reads.

small RNA ברקמות סרטן השד באמצעות miRNAsחיזוי sequencing

miRBase זהו מסד נתונים שמכיל את הרצפים הידועים של

microRNA. מטרותיו:

microRNAs -לספק מערכת שמות עקבית של הידועיםmicroRNAs -איגוד של כל רצפי ה

.microRNA targets - לצבור ידע על ואת הרצף.miRNA -מכיל מידע על מיקום ה

small RNA ברקמות סרטן השד באמצעות miRNAsחיזוי sequencing

FASTQ

תרשים זרימה של אופן פעולת miRanalyzerהתוכנה

Read count(RC) Clean RC

Perl script

Aligns to DB

Algorithms

Keep for microRNA prediction

small RNA sequencing ברקמות סרטן השד באמצעות miRNAsחיזוי

Vienna RNA ו Bowtieגם תוכנה זו משתמשת ב package

Readsהתוכנה נותנת את המידע הבא: מזהה את ה המתאימים, את אורך הרצף שלהם, מיקומים שאליהם

בגנום ועוד. read, מיקום של ה readמופה , רצף הmiRDeep2 package מודולים:3 מכיל

1.miRDeep2 module שמזהה miRNAs ידועים וחדשים, מודול ראשי.

2.Mapper module שממפה את ה reads .לגנום 3.Quantifier module שסוכם את ה reads של ה

miRNAs.הידועים

small RNA sequencing ברקמות סרטן השד באמצעות miRNAsחיזוי

mirDeep2miRanalyzer

PerlJavaשפה

Open sourceלאכן

פירוט קריאות חיצוניותלא קייםקיים

מספר חיזוייםרבמועט

זמן ריצהקצרמתמשך

html, pdf ,txtפורמט פלט

חווית משתמש במהלך מורכבידידותיההתקנה

small RNA ברקמות סרטן השד באמצעות miRNAsחיזוי sequencing

מהלך העבודה דגימות בשתי התוכנות 66הרצת סט של לקיחת הנתונים הרלוונטיים מכל פלט ביצוע חיתוך בין פלטי התוכנות במטרה לקבל בסיכוי

TRUE POSITIVEגבוהה יותר חיזויים שהם אופן הביצוע של החיתוך- לקיחת עמודות מתאימות יצירת קובץ פלט גדול שמכיל את החיזויים המשותפים

עבור שתי התוכנות

small RNA ברקמות סרטן השד באמצעות miRNAsחיזוי sequencing

החיתוך בין התוכנות

miRDeep המשותפים לתוכנות predicted novel miRNAsהחיתוך בין ה.miRanalyzerו-

small RNA sequencing ברקמות סרטן השד באמצעות miRNAsחיזוי

ER + לעומת ER-: בתאי סרטן שד מסוימים , קיימים על פני שטח התא קולטנים לאסטרוגן. סרטן מסוג זה נקרא

, השפעתו +(ER)סרטן חיובי לקולטני אסטרוגןמעודדת הצמיחה של ההורמון אסטרוגן עלולה במקרים מסוימים לגרום לצמיחתה של רקמה

ממארת בשד.

small RNA ברקמות סרטן השד באמצעות miRNAsחיזוי sequencing

PR+ לעומת PR-: ,בתאי סרטן שד מסוימים קיימים קולטנים לפרוגסטרון

תאים אלו זקוקים לפרוגסטרון כדי להתפתח, גידולים , +( PR)מסוג זה נקראים חיוביים לקולטני פרוגסטרון

בשונה מגידולים שהורמון זה לא מאיץ את התפתחותם . פרוגסטרון הוא הורמון מין המופרש -PRונקראים

בעיקר מן הגופיף הצהוב שבשחלה לאחר ביוץ. הפרוגסטרון מופרש במידה קטנה יותר מבלוטת יותרת הכליה, מן השליה במהלך ההריון , ובגברים מהאשכים.

small RNA sequencing ברקמות סרטן השד באמצעות miRNAsחיזוי

HER-2:Human Epidermal Growth Factor Receptor

הוא חלבון מסוג מיוחד ) קולטן( הנמצא באופן תקין ברמות נמוכות על פני השטח של תאים ברקמת השד. ל

HER2 תפקיד חשוב בבקרה על גדילתם וחלוקתם שלתאים תקינים. פעילות יתר שלו גורמת לחלוקה מוגברת

אחוזים מגידולי השד 20של תאים, נמצא כי בערך החודרניים מבטאים חלבון זה בכמות גדולה מהרגיל.

חלבון זה שולט על תהליך החלוקה וההתפשטות של תאי גידולים המבטאים כמות גדולה הגידול הסרטני בשד.

. נשים HER2-positiveמהרגיל של החלבון נקראים חולות סרטן שד המאובחנות כסובלות מרמות גבוהות של

HER2 .סובלות מצורה אלימה במיוחד של סרטן שד

small RNA sequencing ברקמות סרטן השד באמצעות miRNAsחיזוי

המטרה למעשה, רציתי למצוא את הmiRNAs המשותפים לכל

תת קטגוריה. לבדוק מהם הmiRNAs שבהם יש זהות בין כל תת סוג

של קטגוריה, וע"י מציאת ההבדלים בין תת הקטגוריות שיאפיינו את תת סוג הסרטן.miRNAsלמצוא

הצגת התוצאות באמצעות שימוש בכליR באמצעות ,VENN DIAGRAM

small RNA sequencing ברקמות סרטן השד באמצעות miRNAsחיזוי

Predicted novel miRNAs ER+ and ER-

11 predicted novel miRNAs המבדילים את הדגימות ER- שנחזו ע"י שתי התוכנות, + ER המבדילים את הדגימות predicted novel miRNAs 46וכן ישנם

small RNA sequencing ברקמות סרטן השד באמצעות miRNAsחיזוי

Predicted novel miRNAs PR+ and PR-

11 predicted novel miRNAs המבדילים את הדגימות PR- שנחזו ע"י שתי התוכנות,

+PR המבדילים את הדגימות predicted novel miRNAs 18 וכן ישנם

small RNA sequencing ברקמות סרטן השד באמצעות miRNAsחיזוי

Predicted novel miRNAs HER2+ and HER2-

8 predicted novel miRNAs המבדילים את הדגימות HER2- שנחזו ע"י שתי התוכנות,

+ HER2 המבדילים את הדגימות predicted novel miRNAs 21וכן ישנם

small RNA ברקמות סרטן השד באמצעות miRNAsחיזוי sequencing

מסקנות והמשך.... החשיבות של ביטויmiRNAs במצבים סרטניים קיבלה

משמעות חדשה בשנים האחרונות, מולקולות אלו משחקות תפקיד משמעותי במצבי חולי ותורמות להתפתחות גידולים

משותפים miRNAsסרטניים. בתוצאות שקיבלתי נראה שיש השונים בין miRNAsלכל תת סוג של גידול בסרטן השד, ה

תת הסוגים מבדילים בין סוגי הסרטן , נתונים אלו יכולים להוות מידע מבוסס למחקר ביולוגי ע"מ לבדוק האם ה

miRNAs יכולים לאפיין פרופיל של סוג הסרטן. כהמשך novel miRNAsלמחקר זה, ניתן יהיה לבדוק את רשימת ה

שהתקבלו ולבחון את אתרי המטרה שלהם ואת הקשר שלהם אלו יכולים לשמש כמרקרים , אם miRNAsלסוג הסרטן.

ימצאו כמשפיעים על סוג הסרטן, וכן כאמצעי לבחירת טיפול מתאים לחולות

small RNA sequencing ברקמות סרטן השד באמצעות miRNAsחיזוי

תודה על ההקשבה

תודה ל:ד"ר סול עפרוני

מוריה כהן